Biomedicinsk Analytiker

Sveriges största site för Biomedicinska Analytiker

CoverStainer och Ventana utför färgningar

Ett nytt år har börjat, och på jobbet händer massor av spännande saker! Vi håller på att validera en inbäddningsmaskin. Det kommer att frigöra oss biomedicinska analytiker från den manuella inbäddningen så att vi kan fokusera på att snitta. Under våren ska vi dessutom börja använda ett nytt IT-system som kommer innebära att vi blir papperslösa. Själv har jag påbörjat min upplärning på färgen,och har just nu fokus på våra automatiserade färgningar som görs med CoverStainer och Ventana. Jag har redan skrivit en hel del om färgning tidigare, och för att få lite djupare förståelse av just det här inlägget kan det vara bra om du har läst inlägget Hematoxylineosin är den vanligaste översiktsfärgningen.

CoverStainer utför rutinfärgningen

Varje morgon börjar jag med att starta upp CoverStainer. Den är till för helautomatiserad rutinfärgning med hematoxylineosin (HE). Men förutom att färga kan den också montera glas, dehydrera, och avparaffinera. Så fort jag har satt på maskin börjar den värma upp en liten kammare där glasen ska avparaffineras innan de färgas. Vi kallar det för att glasen bakas. Temperaturen ska upp till 65 grader. I samband med snittning hängs glasen på plastrack, 10 glas på varje rack. När man sedan vill stoppa in ett rack i CoverStainer trycker man på en knapp och en liten ”arm” ploppar ut ur maskinen. På den armen finns det plats för fyra rack, alltså totalt 40 glas. Glasen hamnar hängande lodrätt.

Rehydrering med hjälp av CoverStainer

Glasen värms i kammaren i ca 10 minuter. Under den tiden smälter paraffinet och vävnaden bränner fast på glaset så att den inte lossnar under färgningen. Sedan sköljs paraffinet bort med hjälp av två xylenbad. Därefter måste vävnaden rehydreras. Anledningen till det är att färgerna eosin och hematoxylin är vattenlösliga. De fäster inte på vävnad som saknar vatten.

Färgning i CoverStainer

Olika celler har olika storlek, och därmed också större eller mindre inbidningsställen för färgen. Om man börja med att färga större celler blockerar man möjligheten att färga de mindre. De täpps liksom till av färgen som binder till de större. Därför ska man generellt alltid tänka på att börja färga in vävnader med små celler innan man färgar vävnader med stora celler. Detta gäller i samband med all färgning. När vi färgar med HE börjar man alltid med att färga de pH-sura cellkärnorna med det basiska ämnet hematoxylin. Deras färg blir lila-blå. Sedan doppas glaset i destillerat vatten så att överskottsfärg kan sköljas av. Därefter hamnar glaset i bluing buffer.

Bluing buffer har ett exakt pH på 7,0. Detta gör att snittets laddning (pH) stabiliseras. Överskottet av bluing buffer sköljs av och snittet kan sedan färgas in med det basiska eosinet då de pH-sura delarna av snittet så som cytoplasma, kollagen och muskelfibrer färgas röd-rosa. Nu är snittet färgat, men det innehåller fortfarande vatten.

Dehydrering och montering

Om man låter vattnet finnas kvar i snittet kommer det snart att förstöras. Därför är det viktigt att dehydrera det för att få bort vätskan och kunna bevara det under många år. Snittet måste därför dehydreras. Det doppas i flera etanolbad, från koncentrationen 70 till 99,5 %. När ett snitt doppas i flera bad efter varandra, där baden innehåller samma kemikalie i samma koncentration är det alltid det första badet som är det renaste. Jag förklarar detta lite tydligare under rubriken dagligt underhåll. Efter etanolen badas snitten i tre bad xylen, eller histoclear som är ett substitut för xylen. Den största skillnaden mellan xylen och histoclear är att det senare luktar bättre. Glasen monteras också automatiskt, och i sista steget torkas de innan man kan plocka ut dem ur CoverStainer.

Intern kontroll

Men innan vi börjar ladda på alla glas med patientprover i maskin måste vi köra en kontroll. Den består av ett enkelt hudsnitt som färgas in med HE. När färgningen av glaset är klar mikroskoperar jag det. Om färgningen ser bra ut godkänner jag kontroller och signerar ett loggblad. Om kontrollen skulle underkännas måste vi börja felsöka. Det har skett en gång hittills, under min upplärning.

Problemlösning

Kontrollen svar oskarp och såg nästan pastellfärgad ut. Vad som hade hänt då var att snittet hade lagts på fel sida om glaset. När CoverStainer monterade glaset hamnande täckglaset på en sida, medan snittet låg på andra sidan. Då blir det oskarpt i mikroskåpet. Vi löste det genom att doppa glaset i xylen, ta loss täckglaset och montera om det. När jag sedan mikroskoperade glaset igen såg fägningen fin ut, och jag kunde godkänna kontrollen.

Dagligt underhåll av CoverStainer

Som jag skrev ovan är alltid det första badet det renaste om ett glas doppas flera gånger efter varandra i en och samma kemikalie (med samma koncentration). Man vill ju att snitten blir rena, utan kontamination. Men hur går det till när vissa bad är renare än andra? Varje morgon gör jag det som kallas för dagligt underhåll på maskinen. En del av flaskorna med de olika kemikalierna ska tömmas och sköljas ur för att sedan fyllas på med ny fräsch kemikalie. Men inte alla. Vissa kemikalier byts mer sällan, och då roteras på ett sådant sätt att den renaste alltid kommer först.

Till det dagliga underhållet hör också att fylla maskinen med täckglas och mounting media som är det klister som maskinen använder sig av för att montera täckglasen på objektglasen. I samband med monteringen används också xylen. Monteringen kräver en droppe xylen på objektglaset innan mounting media och täckglas kan läggas på. Det förebygger luftbubblor. Xylenet som används till detta byts ut varje morgon.

Ventana utför automatiserad specialfärgning

Det finns flera specialfärgningar som används till olika syften; AB-PAS, PAS och PAS-D differentierar muciner och kolhydrater. Färgen Kongo Röd är gold standard vid misstänk amyloidos. Dessa färger, tillsammans med bland annat Fe (järn) och GMS Grocott färgar vi automatiskt i en annan maskin (Ventana). Andra specialfärger färgar vi manuellt. Till dem hör bland annat siriusrött, van Gieson, och von Kossa.

De automatiserade specialfärgningarna är ungefär lika enkla att utföra som rutinfärgningen. Glasen etiketteras med en speciell etikett som markerar vilken specialfärg på glaset. Sedan läggs glasen, ett och ett, på metallplattor på en snurra (kallas för karusell) inne i maskin. Maskinen stängs och på ovansidan av locket finns en annan karusell där man placerar färgburkarna. Nya burkar har LOT-nummer som ska registreras i datorn innan den används. Både färgburkarna och glasen har etiketter som maskinen läser av. Den kontrollerar att färgerna stämmer överens med de glas som ska färgas. Man ”knäpper fast” burkarna och öppnar dem. Sedan är det bara att trycka på start.

Längst ner i maskinen finns stora dunkar med vätskor som behövs för färgning och underhåll; avparrafineringslösning, ett slags mounting medium, och wash som är som ett diskmedel. Vi blandar dessa lösningar själva och fyller på när det behövs.

Intern kontroll

Vissa av våra automatiserade specialfärgningar kräver en internkontroll. Ett exempel på detta är järnfärgningen. Då sitter det ett leversnitt på glaset, och nedanför det placeras patientprovet. När glaset sedan har färgats mikroskoperas det. Då ska  det övre leversnittet vissa på inlagringar av järn. Gör det inte det har färgningen misslyckats och glaset underkänns.

Kvalitetskontroll

När maskinen jobbat klart är glasen färgade men inte monterade. Många specialfärgningar hanteras genom att de sköljs för hand i destillerat vatten innan jag stoppar in dem i CoverStainer som dehydrerar och monterar dem. Till skillnad från all HE-färgningar måste varje glas som färgats med en specialfärgning kvalitetskontrolleras var för sig. Det gör genom mikroskopering. Om färgningen ser bra ut (rätt färgning, den har skarpa kontraster) så godkänns glaset.

Alcian Yellow är en känslig färg som kräver speciell efterbehandling

Alcian Yellow är en väldigt känslig färg. Den andas i stället för AB-PAS. Den består av två frgen, en gul och en blå. Så fort färgningen är klart måste den omedelbart dehydreras för hand, annars försvinner den gula färgen och det kan bli en felbedömning. När monteringen är klar görs kvalitetskontrollen genom mikroskopet innan glaset kan godkännas.  

Dagligt underhåll vid automatiserad specialfärgning

Det dagliga underhållet på Ventana-maskinerna är till skillnad från CoverStainer väldigt enkelt. Efter färgning sköljs plattorna som glasen har legat på med destillerat vatten, och torkas av med en fin duk. Sedan kör jag ett rengöringsprogram med speciella burkar som innehåller rengöringsprodukter. Det görs en gång per dag. Maskinen ska också torkas av med en fuktig duk under karusellen som färgerna sitter på, samt utvändigt.

Du kan läsa mer om HE-färgning, protokollet, se en del fina bilder och få tips på felsökningar om du läser Cindy Sampias och Geoffrey Rolls artikel H&E Staining Overview: A Guide to Best Practices. Den finns på Leicas webbsida

En kommentar på “CoverStainer och Ventana utför färgningar

  1. Leila
    25 januari, 2020

    Jag älskar din blogg

Vad tycker du?

Denna webbplats använder Akismet för att minska skräppost. Lär dig hur din kommentardata bearbetas.

Information

Detta inlägg publicerades på 25 januari, 2020 by i Arbetsliv.
%d bloggare gillar detta: