Hematoxylineosin är den vanligaste översiktsfärgningen

Har du läst mitt senaste inlägg om färgning av histopatologiska preparat; översiktsfärgningar och specialfärgningar? Det var en liten introduktion till en serie inlägg som handlar om färgning. Det här är det första inlägget i serien och handlar om den typ av färgning som kallas för översiktsfärgning. Inlägget riktar sig främst till de biomedicinska analytiker ska läst eller läser biomedicinsk laboratorievetenskap som huvudämne. Biomedicinsk laboratorievetenskap är för dig som vill arbeta på labb.

Om du vet hur översiktsfärgningar fungerar kanske du vill hoppa vidare till något av mina inlägg som handlar om specialfärgningar på en gång? I så fall föreslår jag att du läser inlägget AB-PAS, PAS och PAS-D differentierar muciner och kolhydrater. 

Hematoxylineosin

En av de absolut vanligaste färgningarna som görs inom histopatologin är den som görs med hematoxylineosin. Oftast förkortar man det och säger HE-färgning. Det är en så kallad översiktsfärgning. En översiktsfärgning visar ett preparats vävnader och celler.  Du kan avgöra om alla celler och vävnader finns där, om vävnadslagren har den tjocklek de ska ha eller om något ser avvikande ut. Ofta räcker det med en översiktsfärgning för att patologen ska kunna sätta en diagnos, men ibland önskas också en specialfärgning att jämföra med HE-färgningen. Och vet du; HE-färgen består egentligen av ett basiskt ämne som inte är en färg (hematoxylin) och den sura färgen eosin. Genom att skapa kemiska reaktioner i färgbadet kan du få dessa två ämnen att komplettera varandra och färga olika delar av ett preparat. Vi ska gå igenom hur det går till.

En av de riktigt viktiga sakerna att få grepp om och förstå när man arbetar med hematoxylineosin och andra färger är att ett pH-värde påverkar en vävnads oxidation. Ett surt pH , för att nämna ett exempel, har en hög koncentration av vätejoner, vilket leder till att det bli lättare för vävnadens aminosyror av jonisera. Om du vill bli påmind om hur pH och joner samverkar föreslår jag att du läser inlägget pH är värdet som fixar bufferten och dess ekvivalenspunkter.

Hematoxylin

Hematoxylin är ett basiskt ämne som egentligen är lite märkligt i färgsammanhang, det tycker i alla fall jag. Det är som sagt var inte en färg. Ämnet saknar nämligen kromofor. För att det ska kunna färga ett preparat måste du först tillsätta ett annat ämne (exempelvis natriumjodat), som kan oxidera hematoxylinet. När det skett bildas en positivt laddad produkt som heter hematein. Sedan måste du dessutom tillsätta ett betningmedel.

Ett betningsmedel är ett ämne som hjälper hemateinet att binda. Betning kan användas i många olika situationer inom olika industrier. Det finns alltså olika ämnen som används beroende på sammanhang. Men just när det kommer till färgning av vävnad med hjälp av hematoxylin används ofta järn eller aluminiumsalter. När aluminiumsulfat har tillsats blir färgen sur. Det finns plötsligt en massa fria vätejoner i lösningen, de är positivt laddade.

Då kan färgen binda in till det negativt laddade DNA:t som finns i snittet. För att var specifik: hemateinet binder in till lysinrester i cellkärnans histoner. Färgen är lila. Samtidigt färgas också preparatets övriga delar alldeles för starkt av hemateinet. Om du skulle lyfta upp glaset ur färgbadet nu, och mikroskopera det, skulle du inte kunna urskilja särskilt många detaljer. Det är precis som det ska vara i det här skedet av färgningsprocessen.

Genom att placera glaset med snittet som du färgar i en lösning som är mer basisk är den sura färgen (som exempelvis kranvatten) ökar pH-värdet och vidare infärgning hämmas. Den färg som färgat något annat än cellkärnorna sköljs dessutom bort. Processen kallas för blåning och skapar en stark kontrast mellan de infärgade cellkärnorna och resten av preparatet. Cellkärnorna får sin starkt blåa färg, medan bakgrunden mattas av. Nu har du kommit halvvägs genom färgningen  med hematoxylineosin.

Eosin

Men för att få en helhetsbild av ett preparat räcker det naturligtvis inte med att se cellkärnorna. För att kunna se resten av cellen – och hela preparatet – färgas det också med den andra färgen som ingår i kombinationen av hematoxylineosin; och det är naturligtvis eosinet.

Som jag skrev i börjar av inlägget har ett färgbad med ett surt pH-värde en hög koncentration av vätejoner. Det gör det lättare för eosinet att binda in till vävnaden. Du kan tillsätta ättiksyra till eosinet. Det är surt och har alltså fria vätejoner. Det leder till att en aminogrupp i preparatets vävnad kan dra till sig lite av ättiksyrans vätejoner. Då blir vävnaden positivt laddad och drar till sig det negativt laddade eosinet som binder in. Det är de acidofila delarna av cellen som färgas av eosinet. Exempelvis cytoplasman. Men kom ihåg att du måste skölja av glaset med ditt färgade snitt i vatten innan det får torka och kan mikroskoperas.

Resultatet

När du färgar vävnad med hematoxylineosin kommer olika delar av vävnaden att ha färgats på olika sätt; kollagen färgas ljust rosa, muskler mörkt rosa, acidofil plasma blir röd medan den basofila cytoplasman blir lila. Cellkärna blir som sagt var blå. Och skulle det vara så att det finns blod kvar i preparatet vilket faktiskt ofta händer, så färgas erytrocyterna röda. Du kan framför allt se dem på insidan av snittets blodkärl.

Källa

Aladdin. Hematoxylin & Eosin Staining Protocol. (Hämtad 2018-12-08).

Brown, S. The Science and Application of Hematoxylin and Eosin Staining. Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center. Northwestern University. USA. 2012. (Hämtad 2018-12-08).

Cook, D J. & Warren, P J. Cellular Pathology. An introduction to Techniques and Applications. Tredje upplagan. Scion Publishing Limited; Indien. 2015.

Ellis, R. Hematoxylin & Eosin (H&E) Staining Protocol. IHCWORLD. Life Science Products & Services. (Hämtad 2018-12-08).

Karlsmo, J. & Shokohideh, L. HTX-eosin/erytrosin. Equalis 2017 utskick. 2017. (Hämtad 2018-12-08).

Ruegg, A. & Meinen, S. Histopathology in Hematoxylin & Eosin stained muscle sections. University of Basel, Switzerland. 2014. (Hämtad 2018-12-08).

Seminoma. HE-färgning. Foto: Ed Uthman, patolog i Houstan, Texas, USA. Bilden är hämtad från Flickr: https://www.flickr.com/photos/euthman/268018287/in/photolist-pFEuX-pEs9g. Licens https://creativecommons.org/licenses/by/2.0/

Vad tycker du?

Denna webbplats använder Akismet för att minska skräppost. Lär dig hur din kommentardata bearbetas.