Dehydrering har avgörande betydelse för det histopatologiska arbetet

Under min utbildning prövade jag och mina klasskamrater vid något tillfälle på dehydrering som en del av kunskapsinhämtningen. Vi fick allihop varsitt snitt av ett vävnadspreparat som snittats färskt inne på patologen och sedan lagts upp på objektglas. Dessa objektglas fick vi studenter under en laboration doppa i små glas med olika vätskor. Syftet var att dehydrera vävnaden manuellt. Inom vården görs det med hjälp av dehydreringsmaskiner.  Därefter färgade vi preparaten innan vi kunde mikroskopera dem. Jag skrev dock inte så mycket på just temat dehydrering under min utbildning, så jag tänkte fördjupa det ämnet idag.

Fixering, dehydrering, bäddning, snittning och färgning

För att du lättare ska kunna förstå dehydreringen och dess olika steg är det viktigt att först förstå helheten; alltså vad som sker med vävnaden både före och efter dehydreringen. Och varför. Vävnaden kan komma från både operation, biopsier och obduktion. När den kommit till patologen ligger den oftast redan i formalin.

Fixering

Formalin är en kemisk lösning, en vätska, som hindrar vävnaden från att torka ut och förstöras. Den fixerar vävnaden. Så fort du har tagit celler från kroppen börjar dessa att brytas ner och dö. Det är olika enzymer i vävnaden som orsakar detta. Det är viktigt att förhindra det från att ske, så att cellerna är så hela och stabila som möjligt. Då kan läkaren lättare ställa rätt diagnos. Hade du lagt vävnaden i vatten hade du påbörjat en förruttningsprocess. Formalin bevarar alltså vävnaden.

Utskärning

En specialiserad läkaren, alltså en patolog, (ibland kan det till och med vara en specialiserad biomedicinsk analytiker med delegering), tar emot organet eller vävnaden. Utvalda delar som du vill titta närmare på skärs först i tunna skivor som har en tjocklek på maximalt 5 mm. Vävnadsbitarna läggs i något som kallas för kassetter, som små korgar gjorda av plast. Kasetterna har nästan storleken av en liten tändsticksask. Dessa kasetter läggs under arbetsdagens gång i en burk med formalin för att inget ska förstöras.

Dehydrering

När arbetsdagen är slut ska vävnaden dehydreras. Det sker genom att alla kasetterna placeras i en dehydreringsmaskin som gör sitt jobb under natten. Varje dehydrerad vävnadsbit plockas morgonen därpå ut ur sin kasett för att bäddas in i paraffin. Det momentet kalas för inbäddning.

Inbäddning

Vid inbäddning placeras vävnaden i en liten metallskål som står på en het platta. Skålen har ungefär samma storlek som en liten tändsticksask, det ska vara så att vävnadsbiten får plats men inte mer än så. Skålen fylls med flytande paraffin, och medan en biomedicinsk analytiker trycker vävnaden mot botten flyttas skålen över till en kylande platta. På bara någon halv minut har vävnaden frusit fast i botten av metallskålen. Du fyller på mer paraffin och lägger på en numrerad plastram från kasetten över. Tillsammans blir vävnaden, paraffinet och plastramen från kasetten till en hård kloss. Den här klossen ska snittas.

dehydrering
Slädmikrotom

Snittning

Snittning innebär att klossen snittas i tunna skivor med hjälp av en maskin som kallas för mikrotom. Klossen läggs på en kylplatta och kyls till ca – 5 C. Sedan placeras den i mikrotomens preparathållare. Denna rör sig upp och ner med klossen mot en sylvas kniv. När jag jobbar vid en mikrotom tänker jag ofta på hur en symaskin fungerar. Resultatet blir tunna, tunna skivor av vävnad inbäddad i paraffin. Dessa placeras med hjälp av en pensel eller en picett på vattenbad. Vattenbadet gör så att snittet sträcks ut. Ett enda litet veck skulle ju se ut som Grand Canyon när du tittar på preparatet i ett mikroskop! Sedan fiskar du upp snittet på ett objektglas. Nu ska det färgas.

Färgning

Glasen placeras i en färgningsmaskin. De färgas med olika färger beroende på vad det är för vävnad och vad det är för frågeställning. Den vanligaste färgningen är hematoxylin-eosin. De finns många olika färger, både ”vanliga” och immunhistologiska. Det finns oerhört mycket att skriva om ämnet färgning. Det tar vi en annan gång.

Mikroskopering

Det färdiga preparatet lämnas in till patologen som mikroskoperar det och gör en bedömning av hur celler och vävnadslager ser ut. Svaret skickas till patientens läkare. Så nu vet du ganska väl hur processen då vävnaden bearbetas ser ut. Så… vad är det egentligen som händer under själva dehydreringen då, och varför?

Nu har du fått helheten, så nu är det dags att verkligen djupdyka i det här med dehydrering. Vad är det, hur fungerar det och vad ska det vara bra för?

Dehydrering

Syftet med dehydrering är att få bort vatten ur vävnaden för att den inte ska ruttna, alltså det vatten som fanns i vävnaden när exempelvis tumören lämnade patientens kropp. Precis efter dehydreringen sker också ett moment som kallas för clearing och sedan infiltration. Dehydrering, clearing och infiltration är alltså tre olika moment, men oftast brukar laboratoriepersonalen bara säga ”dehydrering” trots att en kunnig laborant menar alla tre. När jag skriver om dehydrering så menar jag de som sker innan clearing och infiltration sker. 

Från 70 till 99,5

I mitt inlägg Diffusion, Filtration och Absorption kan du läsa om hur diffusion fungerar i detalj. Vatten förs över cellmembranet, antingen in i eller ut ur celler, för att koncentrationen av vatten ska vara densamma på båda sidorna om membranet. Det här sker helt naturligt inne i vår kropp, exempelvis som en del i Njurens funktion. Den här kunskapen använder du dig av när du vill dehydrera vävnad.

Genom att låta vävnaden bada i alkohol låter du helt enkelt vattnet som finns i vävnadens celler diffundera ut. I början finns det vatten i cellerna, men alkohol runt dem. Vattnet diffunderar ut i syfte att koncentrationen av vatten ska jämnas ut och bli densamma både inne i och utanför cellen. Men eftersom vävnaden ligger i mängder av etanol med hög alkoholhalt bli vattenkoncentrationen aldrig utjämnad. Istället slutar dehydreringen med att vattnet i alla cellerna helt och hållet ersatts med etanol.

Dehydrering skapar ett problem

Det är lätt att tro att cellerna skrynklar ihop sig eftersom den blir hypertonisk, och de skulle de göra om du inte var försiktig. Men först har ju vävnaden fixerats när den förvarats i formalin. Fixeringen förebygger att cellerna skrynklar ihop sig. Sedan får dehydreringen inte ta för lång tid, och det är viktigt att vävnadsbadet påbörjas i en alkoholhalt som är ganska låg: 70-procentig etanol. Därifrån stiger alkoholhalten i bestämda tidsintervaller upp till 90 och vidare till 99,5 % alkohol.

Nu har det uppstått ett problem som måste lösas. Vävnader ska så småningom bäddas i paraffin. Men vävnaden är ju full av etanol nu, och etanol går inte ihop med paraffin. Parrafinet som används för inbäddning av vävnadsbiten är ett hydrofobt ämne som du kanske vet. Testa att droppa stearin från ett brinnande ljus i ett glas sprit och se vad som händer. Det kommer inte att blandas. Istället skulle paraffinet stelna som en klump i spriten. Det är nu vi kommer till clearing.

Clearing

Eftersom den dehydrerade vävnaden först ska dränkas i paraffin och sedan också bäddas in i det kan du alltså inte ha någon etanol i vävnaden. Den måste tas bort. Detta görs genom att du tillsätter ett intermedium, alltså ett ämne som kan blandas med både etanol och paraffin. Ett sådant ämne är xylen.

Xylen fungerar ihop med både etanol och paraffin. Och det är ju smart! Under xylenbadet kan etanolen som finns i vävnaden ersättas med xylen. Samtidigt är xylen ett ämne som paraffinet inte klarar av att stöta bort.

Infiltration

När vävnaden fyllts med xylen får den alltså bada i flytande paraffin. Paraffinet kan då tränga in helt och hållet i vävnaden. Syftet med det är att sedan låta vävnaden som impregnerats med paraffinet bäddas in –  i mer paraffin. När detta stelnat har du en hård och stabil kloss som kan snittas. Vävnaden måste vara hård för att kunna snittas, annars skulle den bara vika sig…

Källa:

Bryant, Ph. Tissue sampling, processing and staining. Processing. United Kingdom. (Hämtad 2018-05-12).

Bunne, Ch. Ett operationspreparats resa. Sterilteknikutbildningen. Sollefteå Lärcenter. Sollefteå kommun. 2013. (Hämtad 2018-05-12).

Klinisk Patologi och Klinisk Genetik. Verksamhetsförlagd utbildning. 2016-03-04. Linköpings Universitet.

Mohseni, S. Histokemisk färgning. Laboration. Termin 3. Hösten 2014. Linköpings Universitet.

Wilson, M. Tissue Processing For Histology: What Exactly Happens? 2017. (Hämtad 2018-05-12).

Vad tycker du?

Denna webbplats använder Akismet för att minska skräppost. Lär dig hur din kommentardata bearbetas.