Mikrobiologi är läran om mikroorganismer; bakterier, virus, svamp och kanske nån parasit. Förutom att identifiera de här mikroorganismerna genom existerande metoder arbetar en biomedicinsk analytiker också med att utveckla metoderna vidare. Att utveckla de metoder som används på ett laboratorium är alltid viktigt. Som biomedicinsk analytiker är du ofta metodansvarig på sin arbetsplats, och då bidrar du till att utveckla metoden. Användandet av Maldi-TOF är ett bra exempel på hur en mikrobiologisk metod har utvecklats. Under utbildningen har jag ju beskrivit hur jag laborerat för att analysera bakterierna ifyra okända prover. Det gjorde vi genom att utföra flera olika tester som utfördes efter att bakterierna odlats på agar. Till testerna hör bland annat gramfärgning, oxidastest, katalastest, jäsningsserie i rör och serotypning.

Maldi-TOF snabbar upp analysen

Men genom att använda Maldi-TOF kan analysen både förenklas, utföras mycket snabbare och med betydligt större sensitivitet och sensitivitet. Du får aldrig falskt negativa svar. Du hoppar dessutom över alla tester som gramfärgning och så vidare. I stället odlar du ut bakterierna på en agarplatta precis som vanligt. Om du behöver göra en renodling gör du det. Sedan analyserar du bakterier i Maldi-TOF och på bara några minuter vet du vilken bakterie det är.

Vad är Maldi-TOF och hur går det till?

Maldi-TOF är en förkortning för ”Matrix Assisted Laser Desorption – Time Of Flight” och är en form av masspektrometri. Det är maskin med en databas full av information om bakteriers olika genetik. Till maskinen hör en liten metallplatta full av små runda ringar. Varje ”ring” är platsen för varje bakterie som du vill analysera. Du tar en tandpetare och plockar upp en bakteriekoloni från din renodlade agarplatta. Smeta ut bakterien på en av plattan små ringar. Sedan pipetterar du myrsyra på bakterierna. Myrsyran är till för att lösgöra bakteriens proteiner. När den har torkat pipetterar du ett matrixmedel på samma plats. Det är till för att joniserar proteinerna i bakterierna. 

När allt torkat stoppar du in plattan i Maldi-TOF. Plattan hålls inne i maskinen med hjälp av tryckluft. En laserstråle kommer att riktas mot varje prov. Proteinerna flyger nu genom ett vacumrör. Det sker genom s.k. elektromagnetisk acceleration. Myrsyran denaturerade proteinerna i bakterien, medan matrix joniserade dem så att de kan föras genom röret.

På en sidan röret finns provet, på andra sidan sitter en detektor. Den mäter hastigheten på de joniserade proteinerna; alltså hur lång tid det tar för dem att passera genom det vacumfyllda röret. Hastigheten är proportionell mot massan. Och bakteriers proteiner har alla olika massa. Det betyder att alla bakterier lämnar ett ”fingeravtryck” på detektorn. Det är ett molekylärt fingeravtryck som avslöjar massan på bakteriens protein, och därmed också vilken bakterie det är.

 

Negativ och positiv kontroll

Din negativa kontroll i den här analysen är en tom ”ring” på metallplattan, på vilken du har pipetterat både myrsyra och matrix, men utan bakterier. Analysresultatet ska vara negativt. Din positiva kontroll är en känd bakterie som behandlats på samma sätt som alla dina okända bakterier; alltså med myrsyra och matrix. Resultatet ska vara namnet på den kända bakterien, men ett score-värde ≥ 2300.

Maldi-TOF´s score-värden

Resultatet du får av analysen kommer i form av ett score-värde tillsammans med namnet på bakterien. Det skulle exempelvis kunna stå så här:

Escherichia coli    ≥ 2300

Staphylococcus aureus   ≤ 1699

Salmonella enteretidis   1833

• Varje analys får en slags poäng, alltså ett score-värde. Värdet talar om hur tillförlitligt resultatet är. Alla värden under 1700 saknar tillförlitlighet, de måste göras om. I exemplet ovan måste du alltså göra om testet med Staphylococcus aureus.
• Alla poäng mellan 1 700 och 1 999 innebär att bakteriens art troligen är korrekt, men att genus är osäkert. I exemplet ovan betyder detta att Salmonella enteretidis förmodligen är en typ av salmonella, men du kan inte ara helt säker på att det är just enteretidis.
• Alla score-värden ≥ 2300 innebär att sannolikheten att både art och genus stämmer är väldigt hög. I exemplet ovan är du alltså mycket säker på att Escherichia coli verkligen är en E.coli. Det resultatet kan du svara ut.

När du får osäkra värden från Maldi-TOF kan du göra om testet. Det är också viktigt att komma ihåg att bedömningen av vilken bakterie patienten drabbats av görs i en kombination av en bedömning av patientens symptom, agarplattans utseende, och resultatet från Maldi-TOF.

Källa:

Universitetssjukhuset i Linköping. Klinisk Mikrobiologi. Anteckningar från VFU2. 2015-11-06.

Förslag på fördjupande läsning

År 2015 publicerade Frontiers in Microbiology en artikel med titeln Maldi-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis, skriven av Singhai, N. et al. Läs gärna den!