Biomedicinsk Analytiker

Sveriges största site för Biomedicinska Analytiker

DIYProject: Help Discover New Antibiotics through Citizen Science

Swedish/English Det finns ett kul forskningsprojekt som pågår över hela världen just nu, och som vem som helst kan delta i. Målet med projektet är att hitta ny antibiotika (du screenar efter antibiotika), och det behövs ju verkligen med tanke på all resistens som utvecklas. Projektet heter DIYProject: Help Discover New Antibiotics through Citizen Science. Just det här med ”citizen science” gör det riktigt kul. Det här gör man nämligen hemma!

Det går att beställa små färdiga kit på nätet, som du kan använda. Du går ut i naturen och plocka på dig blad, rötter, bark, jord, insekter, blommor, svamp eller vad man nu vill.  Dessa krossas och placerar på en agarplatta med bakterier. Sedan testar du om det man har plockat har någon dödande effekt på bakterierna.

Jag kommer inte att beställa något kit. I stället kommer jag att – med mina kunskaper som legitimerad biomedicinsk analytiker – bygga upp labbet jag behöver här hemma och sedan utveckla ett standardiserat sätt att arbeta. Resultatet kommer att sparas i en databas, och självklart delar jag med mig av resultatet här i bloggen (CUDOS).

Här kommer ett arbetsexemplar av en blivande metodbeskrivning, så som jag har tänkt mig det hela. Men om du vill göra det här själv, i ditt eget biolabb så kommer du att behöva göra justeringar. Den här metodbeskrivningen är ofullständig och mer tankar om hur jag vill ha det. Den fullständiga metodbeskrivningen delar jag med mig av när jag har något material att presentera, i form av en uppsats. Se den här metodbeskrivningen som ett exempel till för att väcka fler tankar och idéer.

Metodbeskrivning

Material

  • Spektrofotometer (bygg själv, köp eller låna), 1 st
  • CAD-program (finns gratis på Internet), 1 st
  • Kaffefilter, 1 pkt
  • Hålslagarapparat, 1 st
  • 3D-skrivare (bygg själv, köp eller låna), 1 st
  • Färskt blod från ett slakteri
  • Agar-agar
  • Natriumklorid (salt)
  • Mörk choklad alternativt trypton i form av kosttillskott
  • 100 mL kranvatten
  • 5 st. petriskålar (per tillfälle)
  • Bakterier från prov (feaces, urin, hals eller liknande)
  • Tre platinöser
  • Inkubator
  • Vattenfast penna
  • Plastpåsar med ziplås
  • Kamera
  • Mobiltelefon med GPS-system, eller GPS
  • Plockat material från naturen
  • Provrör
  • Rörställ
  • Mikropipett
  • Pipettspetsar
  • Ev. vortex
  • Örontops
  • Mortel
  • Pincett
  • Destillerat vatten
  • Fysiologisk natriumklorid
  • Linjal
  • Dator, med Excel eller annat program där du kan skapa en databas

Metod 

Förberedande

Detta kan göras flera månader innan du börjar labba dag 1, eller dagen innan. Men se till att göra det innan laborationerna börjar. Läs många vetenskapliga artiklar på temat antibiotika och biologiskt material hämtat från naturen. Frågor du bör söka svar på är:

  • Finns det en viss typ av växter som brukar ha antibiotisk effekt? Vad bör du titta efter när du letar växter och sådant?
  • Vilka växter är redan testade?

Gör en inventering av vilken utrustning du har och vad du inte har.

  • Jag kommer att behöva bygga klart och kalibrera spektrofotometern mot en spektrofotometer som används kliniskt.
  • I min dator har jag redan ett CAD-program som är gratis, det heter Strata Design 3D SE 7.  Jag måste lära mig hur det fungerar och rita en platinös i programmet.
  • Platinöserna skrivs ut på någon av MakerSpace 3D-skrivare. (Annars går det ju bra att köpa platinöser via nätet, och då slipper du både CAD-programmet och 3D-skrivaren. Jag gör mina egna platinöser bara för att jag kan och tycker det är kul).
  • Köp kaffefilter. Ta ett kaffefilter och använd hålslagarapparaten till att få fram små ”diskar.” Samla ihop diskarna i ett förvaringskärl med lock.
  • Köp allt annat som behöver köpas enligt listan över material som behövs för laborationen.

Nu till det här med bakterien och valet av denna.

  • Bestäm dig för vilken bakterie du vill testa och håll dig till den hela tiden. Du kan naturligtvis testa många olika typer av bakterier, men det gör hela laborationen mycket mer kostsam, tidskrävande och komplicerad eftersom du i så fall ska hålla dig till alla de bakterier du valt. Jag skulle hålla mig till en enda bakterie tills jag hittat något som kan vara en antibiotika, bekräfta resultatet och sedan utöka testningen till fler typer av bakterier.
  • Kontrollera att bakterien du använder inte är resistent. Det gör du genom att odla fram den på lämplig agarplatta, och sedan gramfärga den, ta ett oxidas- och ett katalastest och kanske göra en jästningsserie i rör. Sedan testar du bakterien mot samma typer av antibiotika som redan används ute på marknaden mot just den bakterie du valt. Antibiotikadiskar finns att köpa online. Kontrollera att det klara området runt disken är så stort eller så litet som det ska vara för varje enskild antibiotikadisk.

Och så skapar du ett referensintervall för antibiotikan.

  • Ta reda på MIC-värdet (minsta inhibitoriska koncentration) för varje typ av antibiotikum som du hade på diskarna när du testade resistensen. Skriv in värdet i en tabell. Testa sedan MIC-värdet för några av de växter som har känd antibiotisk verkan (enligt de vetenskapliga artiklar du läst, tex vitlök). Det gör du för att skapa ett referensintervall. MIC-värdet för vitlöken är ditt höga värde, och MIC-värdet för antibiotikan som redan finns ute på marknaden är ditt låga värde. Ju lägre desto bättre. Lägre koncentration av antibiotika som dödar alla bakterier betyder ju att antibiotika är mer effektiv. Om du hittar en planta med samma MIC-värde som vitlök, då vet du att visst den har antibiotisk effekt, men inte så mycket. Om du hittar en planta med ungefär samma låga MIC-värde som den antibiotika som finns ute på marknaden då har du hittat något som kan fungera som antibiotika! Och om du skulle hitta en planta som har ett ännu lägre MIC-värde än antibiotikan som finns ute på marknaden, då har du hittat något riktigt stort! Om du vill vara ambitiös räknar du alltid ut MIC-värdet för allt du hittar som har antibiotisk effekt och gör ett diagram över det.

Dag 1; Tillredning av agar, hopsamling av bakteriellt prov och utodling på blodagarplatta

Den första dagen ska du göra två blodagarplattor; och du ska odla ut ditt prov från feaces, urin eller hals på en av dem. Den andra plattan är din negativa kontroll. Båda plattorna ska odlas i inkubatorn.

Ta fram två petriskålar och placera dem på ett rent ställe intill platsen där du ska koka ihop agarn. Börja sedan med att koka ihop agarn. Ta fram färskt blod som du fått från slakteriet, agar-agar, natriumklorid, köttextrakt, kranvatten, mörk choklad alternativt trypton i form av kosttillskott, en våg, en liten tallrik, en stor sked och en kastrull i lämplig storlek. Mät upp 100 mL vatten i en bägare eller ett rent glas. Placera sedan den lilla tallriken på vågen och tarera bort dess vikt. Väg sedan upp 1,5 g agar-agar, 0,5 g natriumklorid samt 0,8 g köttextrakt. Häll det i kastrullen och använd dig av kranvattnet till att skölja ner allt från tallriken till kastrullen. Blandningen värms på spisen under omrörning tills dess att agarn är homogen. Blanda ner 5 – 10 % blod i kastrullen, tillsammans med mörk choklad alternativt trypton i form av kosttillskott. Rör om tills blandningen åter igen blir homogen. Nu är blodagarn färdig.

Ta dina två petriskålar och märk dem på undersidan med hjälp av den vattenfasta penna. På den ena skålens baksida skriver ”utodling.” På baksidan av den andra petriskålen skriver du ”negativ kontroll”. Genom att markera petriskålarna blir det lättare för dig att hålla isär dem och inte blanda ihop dem. Det är särskilt bra om något skulle gå fel under laborationen och resultater inte blir som du har tänkt dig. Sådant händer med jämna mellanrum. Häll den varma blodagarn i de två petriskålarna. Lägg locket på agarplattorna och placera dem i kylen så att de får stelna.

När de har stelnat; Använd platinöserna och stryk ut ett prov (feaces, urin, eller halsprov) innehållande bakterier på den blodagarplattan som du markerat ordet utodling. Du ska göra ett primär-, senkundär, tertiär och kvartärutstryk.

Placera sedan blodagarplattan tillsammans med den andra rena blodagarplattan som du markerar med ”negativ kontroll” i inkubatorn. Den rena blodagarplattan är din negativa kontroll. Odla båda plattorna i 8-12 timmar i inkubator, justera tiden efter behov.

Dag 2; eventuellt renodling, insamling av biologiskt material, utodling på nya agarplattor och preparering och utplacering av diskar

Den andra dagen ska du göra en ny agar, kontrollera agarplattorna du placerade i inkubatorn den första dagen och antingen göra en renodling eller två nya agarplattor utan blod. Om den negativa kontrollen är ren och du inte behöver göra någon renodling kommer du få plocka växter i naturen, tillreda dem, göra en bakteriesuspension, odla ut den på ny platta på vilken du placerar diskar indränkta i saften från växterna du samlat. Agarplattorna odlas i inkubatorn.

Om kontrollen är kontaminerad

Börja med att kontrollera om den rena blodagarplattan som du markerat med ”negativ kontroll.” Om den inte är det har du kontaminerat plattorna, du ska fortfarande slänga den med du måste börja om från början med dag 1. Du måste vara noga med vilken bakterie du testar, använd alltid samma bakterie eftersom olika bakterier är olika känslig mot olika typer av antibiotika.

Plattan är kontaminerad. Börja om från början med hela laborationen.

Om kontrollen är ren

Om kontrollen är ren betyder det att du lyckats att hålla dina prover rena. De är inte kontaminerade.

Den negativa konstrollen är ren, alltså inte kontaminerad. Bra, du kan fortsätta med nästa steg i laborationen.

Nu kan du slänga den innan du också kontrollerar blodagarplattan du markerat medutodling och odlat ut ditt prov på. Du ska se bakteriekolonier. Om du har möjlighet är det till stor fördel om du kontrollera vilken bakterie du har på plattan genom knufftest, gamfärgning, eventuellt katalastest, oxidastest och jäsningsserie i rör. Ett knufftest kan du alltid göra, och försök åtminstone beskriva bakteriekolonierna; hur ser de ut i färg och konsistens, vad luktar de? Svärmar de eller inte? Har de orsakar någon hemolys på plattan? Vilken typ av hemolys är det i så fall? Kan du utifrån det ana vad de är för bakterie? Vilken bakterie är den mest troliga, med tanke på varifrån provet tagits? Behöver du göra en renodling?

Om du behöver göra en renodling

Om du behöver göra en renodling tar du fram en ny petriskål. På baksidan av den skriver du ordet ”renodling.” Gör en ny agar, men räkna ut hur mycket du ska använda av varje ingrediens. Du ska ha agar till en enda petriskål. Häll agarn i petriskålen och låt stelna i kyl.

När agarn har stelnat tar du fram den. Plocka också fram blodagarplattan med bakteriekolonierna ur inkubatorn. Titta väldigt noga på kolnierna. Vilken av dem är du intresserad av att isolera? När du bet vilken bakterie du vill ha tar du en platinös och vidrör kolonin du vill ha med den. Gör sedan ett primär-, sekundär, teritiär och kvartärutstryk över din nya blodagarplatta.

Placera den i inkubatorn och odla i 12 timmar och justera tiden efter behov. Efter att plattan odlats i inkubatorn måste du ta fram den igen, och avgöra om du behöver göra en ny renodling eller inte.

Om du inte behöver göra en renodling

Om du bara har en enda bakterieart på din blodagarplatta och inte behöver göra någon renodling tar du fram tre nya petriskålar. Markera dem på undersidan med den vattenfasta pennan; den ena skålen med texten ”antibiotika”. Sedan drar du fyra raka streck över botten på petriskålen på ett sådant sätt att plattan delas upp i åtta lika stora tårtbitar. I varje tårtbit skriver du namnet på de sex biologiska ämnen som du vill testa; ett biologiskt ämne i varje tårtbit. Den andra petriskålens botten markerar du med texten ”negativ kontroll” och den tredje skålen markerar du med texten ”utan antibiotika”.

Syftet med detta är att på plattan märkt ”antibiotika” ska du testa de biologiska material du har samlat på dig, för att se om detta har någon antibiotisk effekt. Plattan märk ”negativ kontroll” är din negativa kontroll precis som ovan; den ska du titta på för att vara säker på att du inte har kontaminerat provet med något. På plattan märkt med orden ”utan antibiotika” ska du odla ut bakterier, men inte tillsätta något biologisk material. Om resultatet av laborationen blir bra ska den plattan vara full med bakterier. Om den inte är det kan du räkna med att något har gått fel. Även om plattan där du testar det biologiska materialets antibiotiska effekter är ren kan du inte dra slutsatsen att materialet fungerar som antibiotika. Nej, det kanske är så att inkubatorn inte fungerat på rätt sätt och att bakterierna inte kunnat tillväxa helt enkelt. Då får du börja om med detta steg och göra nya agarplattor utan blod, och en ny bakteriesuspension från blodagarn som du sparade. Plattan som kallas för ”utan antibiotika” kan lika gärna kallas för positiv kontroll.

Nu när du har märkt de tre plattorna med ”antibiotika”, ”negativ kontroll” och ”utan antibiotika” ska du göra en ny agar i lämplig mängd på samma sätt som tidigare, men utan blod, choklad eller trypton. Häll agarn i de två nya petriskålarna och låt stelna i kyl.

Medan agarn stelnar i kylen ska du gå ut i naturen. Ta med kamera, penna, plastpåsar med ziplås och kniv. Gå ut i naturen och hitta det du vill plocka. Innan du plockar det, ta två fotografier. Ett foto ska föreställa platsen där du plockar. Det andra fotografiet ska tydligt visa det du plockar. Sedan plockar du det vars antibiotiska egenskaper ska testas. Hitta minst åtta olika växter/svampar eller annat, eftersom det finns plats för åtta ämnen på agarplattan och det är både dyrt och kräver jobb att göra samt odla en agarplatta.

Olika bär ute i naturen kan plockas, krossas och testas för sin eventuella antibiotiska effekt.

Placera varje sak du samlar i en egen plastpåse med ziplås. Skriv på påsen dagens datum, vad det är du har plockat, samt på vilken plats du befinner dig i detalj (skriv gärna koordinaterna om du har, du kan exempelvis se koordinaterna på din mobil eller GPS). Du dokumenterar så här noga för att du ska kunna komma tillbaka till exakt samma ställe igen, när du har hittat något som skulle kunna bli en ny antibiotika i framtiden. Då kommer du behöva hitta exakt samma växt igen. Det du skriver på påsen kan se ut så här:

2017-07-08. Maskrosblad. 59°17′37″N, 18°4′59″E

Tänk på att det finns flera koordinatsystem, bestämd dig för vilket du vill använda dig av och håll dig till det.

Gå hem. Gör fysiologisk natriumklorid genom att blanda natriumklorid med destillerat vatten i en bägare (eller ett rent glas från köket). Ställ undan den fysiologiska natriumkloriden till senare, exempelvis på bordet bredvid dig. Ta fram ett provrör och ställ det i ett rörställ. Skriv ”bakteriesuspension” på det.

Märk rören korrekt och ställ dem i ett rörställ.

Ta fram de tre agarplattorna utan blod från kylen, plattorna som du märkte med orden ”antibiotika”, ”negativ kontroll” och ”utan antibiotika”. Ta fram blodagarplattan med bakteriekolonier ur inkubatorn, ställ den upp och ner. Den ska stå upp och ner så att kondens inte bildas i locket på agarplattan. Pipettera ner 500 uL fysiologisk natriumklorid i provröret du märkte med ordet ”bakteriesuspension.” Ta med hjälp av en platinös några bakterier från blodagarplattan och placera dem i röret med fysiologisk natriumklorid. Blanda väl (helst vortexa). Kontrollera koncentrationen av bakteriesuspensionen med hjälp av spektrofotometern. Suspensionens optiska densitet bör ligga mellan 0,3 – 0,6. Blanda eller vortexa bakteriesuspensionen väl en gång till.

Ta en tops, doppa den i bakteriesuspentionen och gör ett utstryk över agarplattan utan blod, den platta som du delat in i sex lika stora tårtbitar och märkt med ordet ”antibiotika”. Du ska inte göra utstryket primärt, sekundärt osv. I stället ska du först göra ett kryss över plattan. Sedan ska du vrida plattan eller topsen på ett sådant sätt att topsen rör sig i en cirkel över hela plattan, utifrån och in. Hela plattat ska täckas av bakteriesuspentionen. Det är bra om du gör det med lite fart, och du får inte doppa topsen i bakteriesuspensionen igen. Då skulle det bli alldeles för mycket bakterier. Lägg på locket på agarplattan och ställ den upp och ner för att hindra kondens på locket. Gör exakt samma sak med din positiva kontroll, alltså plattan som är märkt ”utan antibiotika.”

Den röda markeringen visar hur du ska dra topsen som du doppat i bakteriesuspensionen. Men gör det mycket tätare. Hela plattan ska strykas med suspensionen.

Lägg det första ämnet du vill testa i morteln och krossa det noga så att vätska kommer ut. Om det är ett fast ämne som exempelvis näver kan du behöva tillsätta destillerat vatten. Tillsätt då så lite som möjligt, så att koncentrationen av ämnena i exempelvis nävern förblir så höga som möjligt.

Krossa det du vill undersöka i en mortel.

Ta sedan med hjälp av pincetten en disk (som du ju gjorde tidigare av kaffefilter). Doppa disken i vätskan som finns i morteln och placera sedan disken i rätt tårtbit på agarplattan. Se till att disken är indränkt i rätt ämne och placeras på den tårtbit där namnet på ämnet du testar står skrivet. Tvätta ur mortel ordentligt, ta nästa ämne, och gör exakt samma sak med det. Fortsätt tills dess att alla åtta diskarna är placerade på agarplattan som du har ritat tårtbitarna på.

De svarta prickarna föreställer de indränkta diskarnas placering på agarplattan.

Låt plattan stå med botten ner i några minuter, så att diskarna får fastna på agarn ordentligt. Placera sedan agarplattan i inkubatorn igen, stående upp och ner. Odla i 12 timmar i inkubatorn, justera tiden efter behov. Den andra agarplattan utan blod (platta 5) ska du stoppa in i inkubatorn som den är. Utan bakterier. Den är din negativa kontroll för att säkerställa att du inte kontaminerat provet.

Skapa en databas för dokumentation

Skapa en databas i din datorn, förslagsvis i programmet Excel. Registrera alla dina prover där, med datum, namn och koordinater. Skapa också en särskild mapp för dina fotografier. Märk varje fotografi, exempelvis med datumet och nummer, på ett sådant sätt att fotot kopplas till rätt prov i databasen innan du stoppar det i mappen.

Här ser du ett exempel på hur databasen skulle kunna se ut. Det kanske är bra att ta med domän, rike, klass och så vidare också? Vem vet, du kanske hittar flera antibiotikum och ser ett mönster? De kanske tillhör samma fylum? Då kan det ju vara värt att fortsätta leta där… efter mer.

Tänk på att alla resultat ska dokumenteras, inte bara de som bevisar att ett biologiskt ämne har antibiotisk effekt. Även negativa resultat ska dokumenteras.

Kontrollera att agarplattan som är din negativa kontroll är ren. Sedan kan du slänga den. Ta fram agarplattan som du placerat diskarna på. Kontrollera att det har bildats bakteriekolonier på plattan. Titta noga på diskarna. Om det finns en klar yta utan bakterier runt någon av diskarna, ta fram linjalen och mät diametern av den klara ytan, tvärs över disken. Registrera resultatet i din databas. Ange måttet i enheten millimeter.

När du hittat rätt

När du hittat en växt eller annat som fungerar som antibiotika (du ser en klar zon runt diskarna med saften från ditt biologiska ämne) måste du testa den flera gånger. Bevisa att det inte var slumpen som gjorde att det ser ut som om plantan är bakteriedödande. Och sedan är det lämpligt att bestämma MIC-värdet.

Och tänk på CUDOS – dela med dig av dina forskningsresultat!

På den här bilden verkar bakterien vara känslig mot alla tre typerna av antibiotika. Men det är inte helt säkert att det är så; känslighet och resistens har olika värden (olika diameter i millimeter kring disken) beroende på typ av bakterie och typ av antibiotika. Om din disk ser ut så här ska du rapportera resultatet till experterna, exempelvis något företag som utvecklar läkemedel.

 

In English

There is a fun research project going on all over the world right now, and anyone can participate. The aim of the project is to find new antibiotics (you screen for antibiotics), and it really is necessary given all the resistance that develops. The project is called DIYProject: Help Discover New Antibiotics through Citizen Science. Just this with ”citizen science” makes it really fun. This is something you do at home!

You can order small ready-made kits online, which you can use. You go out into nature and collect leaves, roots, bark, soil, insects, flowers, mushrooms or whatever you want. These are crushed and placed on an agar plate with bacteria. Then you test if it has taken any killing effect on the bacteria.

I will not order any kit. Instead, I will – with my knowledge as a licensed biomedical analyst – build the lab I need here at home and then develop a standardized way of working. The result will be saved in a database, and of course I will share the result with you here in my blog (CUDOS).

Here is a working copy of a future method description, as I have thought about it all. But if you want to do this yourself, in your own bio lab, you will need to make adjustments. This method description is incomplete and just thoughts about how I want it. The complete method description will be shared with you when I have some material to present, in the form of an essay. See this method description as an example to raise more thoughts and ideas.

Method Description

Material

  • Spectrophotometer (build yourself, buy or borrow), 1 pc
  • CAD program (available free of charge on the Internet), 1 pc
  • Coffee filter, 1 package
  • Hole-puncher, 1 pc
  • 3D printer (build yourself, buy or borrow), 1 pc
  • Fresh blood from a slaughterhouse
  • Agar-Agar
  • Sodium chloride (salt)
  • Dark chocolate or trypton in the form of dietary supplements
  • 100 mL tap water
  • Petri dishes, 5 pc (per opportunity)
  • Bacteria from samples (feaces, urine, throat or similar)
  • Inoculating loops
  • Incubator
  • Waterproof pen
  • Plastic bags with zip
  • Camera
  • Mobile phone with GPS system, or GPS
  • Collected material from nature
  • Test tubes
  • Pipe racks
  • Micropipette
  • Pipette tips
  • Ev. vortex
  • Ear tops
  • Mortar
  • Tweezers
  • Distilled water
  • Physiological sodium chloride
  • Ruler
  • Computer, with Excel or any other application where you can create a database

Method

Preparatory

This can be done several months before you start day 1, or the day before. But be sure to do it before the lab begin. Read many scientific articles on the topic of antibiotics in biological materials derived from nature. The questions you should seek answers to are:

  • Is there a certain type of plants that usually have antibiotic effects? What should you look for when looking for plants and such?
  • Which plants are already tested?

Make an inventory of what equipment you have and what you do not have.

  • I will need to build clearly and calibrate the spectrophotometer against a spectrophotometer used clinically.
  • In my computer, I already have a CAD program that’s free, called Strata Design 3D SE 7. I have to learn how it works and draw an inoculating loop in the program.
  • Inoculating loops are printed on any of the MakerSpace 3D printers. (Otherwise, it’s good to buy inoculating loops over the net, so you will not need both the CAD software and the 3D printer. I make my own inoculating loops only because I can and think it’s fun).
  • Buy coffee filters. Take a coffee filter and use the puncher to get small ”dishes.” Assemble the dishes in a storage container with a lid.
  • Buy anything else that needs to be purchased according to the list of materials needed for the lab.

Now to this with the bacteria and the choice of the bacteria you want to work with.

  • Decide what bacteria you want to test and stick to it all the time. Of course, you can test many different types of bacteria, but it will make the entire lab work much more costly, time-consuming and complicated, as you will stick to all the bacteria you have chosen. I would stick to a single bacterium until I find something that could be an antibiotic, confirm the result and then extend the testing to more types of bacteria.
  • Make sure that the bacterium you are using is not resistant. You do this by cultivating it on the appropriate agar plate, and then gram staining it, taking an oxidase and a catalysis test and perhaps making a fermentation series in tubes. Then you test the bacterium against the same types of antibiotics already used on the market against just the bacterium you selected. Antibiotic dishes are available online. Make sure that the clear area around the counter is as large or as small as it should be for each individual antibiotic dish.

And then you create a reference range for antibiotics.

  • Find out the MIC (minimum inhibitory concentration) value for each type of antibiotic that you had on the dishes when you tested the resistance. Enter the value in a table.
  • Then test the MIC of some of the plants that have known antibiotic effect (according to the scientific articles you read, such as garlic). You do this to create a reference range. The MIC value for garlic is your high value, and the MIC value of antibiotics already on the market is your low value. The lower the better. Lower concentrations of antibiotics that kill all bacteria mean that antibiotics are more effective. If you find a plant with the same MIC value as garlic, then you know that sure it has antibiotic effect, but not so much. If you find a plant with the same low MIC value as the antibiotics on the market then you have found something that can act as antibiotics! And if you would find a plant that has an even lower MIC value than the antibiotic that is on the market then you’ve found something really big! If you want to be ambitious, you always calculate the MIC value for everything you find that has antibiotic effect and make a chart of it.

Day 1; Preparation of agar, collection of bacterial samples and cultivation on blood agar plate

On the first day, you should make two blood agar plates; you will grow your test from feaces, urine or throat on one of them. The other plate is your negative control. Both plates should be grown in the incubator.

Take two petri dishes and place them in a clean place next to the place where you will cook the agar. Then start cooking the agar. Take the fresh blood you got from the slaughterhouse, agar-agar, sodium chloride, meat extract, tap water, dark chocolate or trypton in the form of dietary supplements, a scale, a small plate, a large spoon and a well-sized saucepan. Measure 100 mL of water in a beaker or a clean glass. Then place the little plate on the scale and take away its weight. Then weigh 1.5 g agar agar, 0.5 g sodium chloride and 0.8 g meat extract. Pour it into the pan and use the tap water to rinse everything from the plate to the pan. The mixture is heated on the stove while stirring until the agar is homogeneous. Mix 5 to 10% blood into the pan, together with dark chocolate or trypton in the form of dietary supplements. Stir until the reconstitution becomes homogeneous again. Now the blood agar is complete.

Take your two petri dishes and mark them on the underside using the waterproof pen. On the back of one of the dishes write ”cultivation.” On the back of the other petri dish, type ”negative control”. Marking the petri dishes makes it easier for you to keep them apart and not mixing the up with each other. It is especially good if something goes wrong during the laboration and results will not be as you have expected. Such happens on a regular basis. Pour the hot blood layer into the two petri dishes. Place the lid on the agar plates and place them in the refrigerator to allow them to solidify.

Once they have stiffened; use the inoculating loops and smear out a sample (feaces, urine, or throat) containing bacteria on the blood agar plate that you marked with the word cultivation. You should do a primary, secondary, tertiary and quaternary term.

Then place that blood agar plate together with the second clean blood agar plate that you mark with ”negative control” in the incubator. The clean blood agar plate is your negative control. Grow both plates for 8-12 hours in the incubator, adjust the time as needed.

Day 2; Possibly re-cultivation, collecting biological material, cultivation of new agar plates and preparation and placement of antibiotic dishes on plates 

On the second day, you should check the agar plates you placed in the incubator on the first day and either do a re-cultivation on two new blood agar plates (one cultivation and one clean blood agar plates as a negative control); or do two new agar plates without blood. If the negative control is clean and you do not need to do any re-cultivation, you will pick up plants in nature, prepare them, make a bacterial suspension, grow it on a new plate on which you place dishes stuck in the juice from the plants you collected. The agar plates are grown in the incubator.

If the control is contaminated

Start by checking the clean blood agar plate that you marked with ”negative control.” If it has any bacteria, you have contaminated the plates. You should throw it away, and re-start with day 1. You must be sure which bacteria you are testing, always use the same bacterium because different bacteria are different sensitive to different types of antibiotics.

If the control is clean

If the control is clean, it means you have managed to keep your samples clean. They are not contaminated.

Now you can throw it away before you also check the blood agar plate you marked with cultivation. You’ll see bacterial colonies. If you have the option, it is very useful if you check the bacteria you have on the plate by doning a pushing test, a gram staining, possibly catalysis test, oxidation test and a fermentation serial in test tubes. A pushing test can always be done, and at least try to describe the bacterial colonies; what do they look like in color and texture, what do they smell? Do they swarm all over the plate or not? Have they caused any hemolysis on the plate? What kind of hemolysis is that? Do you know kind of bacteria the are? Which bacterium is the most likely, in view of where the sample was taken?

If you need to do a re-cultivation

If you need to do a re-cultivation, you will need a new petri dish. At the back of it you write the word ”re-cultivation.” Make a new agar, but figure out how much you should use of each ingredient. You should have blood agar for a single petri dish. Pour the agar into the petri dish and allow it to cool.

When the agar has stiffened pick up the blood agar plate with the bacterial colonies from the incubator. Look very carefully at the colonies. Which of them are you interested in isolating? When you are sure which bacteria you want, you take a inoculation loop and touch the colony you want with it. Then do a primary, secondary, tertiary and quaternary smear over your new blood agar plate.

Place it in the incubator and grow for 12 hours and adjust the time as needed. After the plate has been grown in the incubator, you need to check it again, and decide if you need to do a new isolation or not.

If you do not need to do a re-cultivation

If you only have one species of bacteria on your blood agar plate and do not need to do any reproductive work, you will get three new petri dishes. Mark them on the back of the bottom with the waterproof pen; one dish with the text ”antibiotics” and draw four straight lines over the bottom of the petri dish in such a way that the plate is divided into eight equal sized pieces of cake. In each cake you write the name of the six biological subjects you want to test; one biological substance in each piece. At the bottom of the second petri dish write the text ”negative control” and on the third dish write ”without antibiotics”.

The purpose of this is that on the plate labeled ”antibiotics” you should test the biological materials you have collected to see if this has any antibiotic effect. The plate label ”negative control” is your negative control just as above; you should look at it to make sure that you have not contaminated the test with anything. On the plate labeled with the words ”without antibiotics” you should breed bacteria, but do not add any biological material. If the result of the laboration is good, it should be filled with bacteria. If it is not, you can expect something went wrong. Although the plate where you test the biological material’s antibiotic effects is clean you can not conclude that the material acts as antibiotics. No, it may be that the incubator did not work properly and that the bacteria simply could not grow. Then you’ll start over with this step and make new blood agar plates and a new bacterial suspension from the blood layer that you saved. The plate called ”without antibiotics” may as well be called positive control.

Now that you have labeled the three plates with ”antibiotics”, ”negative control” and ”without antibiotics”, you should make a new agar in the same amount as before but without blood, chocolate or trypton. Pour the agar into the two new petri dishes and simmer in the fridge.

As the agar solidifies in the fridge, go out into nature. Bring your camera, pencil, plastic bags with zipper and knife. Go out into nature and find what you want to pick. Before you pick it, take two photos. One photo should show the place where you pick whatever you pick. The other photo should clearly show what you pick. Then pick the plant you want to test for antibiotic properties. Find at least eight different plants / fungi or other, as there is room for eight subjects on the agar plate and it is both expensive and requires work to cultivate a agar plate.

Place each item you collect in a separate plastic bag with zips. Write on the bag the date of today, what you have picked, and the location you are at in detail (please write the coordinates if you have, for example, see the coordinates of your mobile or GPS). You document this carefully so that you can get back to exactly the same place again when you have found something that could become a new antibiotic in the future. Then you will need to find exactly the same plant again. What you write on the bag may look like this:

2017-07-08. Dandelion leaves. 59 ° 17’37 ”N, 18 ° 4’59” E

Keep in mind that there are several coordinate systems, decide which you want to use and stick to it.

Go home. Make physiological sodium chloride by mixing sodium chloride with distilled water in a beaker (or a clean glass from the kitchen). Keep the physiological sodium chloride for later, for example on the table next to you. Take a test tube and place it in a pipe rack. Type ”bacterial suspension” on it.

Obtain the three agar plates without blood from the refrigerator, the plates you marked with the words ”antibiotics”, ”negative control” and ”without antibiotics”. Bring the blood agar plate with bacterial colonies out of the incubator, set it upside down. It should stand upside down so that condensation is not formed in the lid of the agar plate. Pipette 500 μL of physiological sodium chloride into the test tube with the word ”bacterial suspension.” Take a inoculation loop of some bacteria from the blood agar plate and place them in the tube with physiological sodium chloride. Mix well (preferably vortexing). Check the concentration of bacterial suspension using the spectrophotometer. The optical density of suspension should be between 0.3-0.6. Mix or vortex the bacterial suspension again.

Take a tops, dip it into the bacterial suspension and make cross at the agar plate without blood, the plate that you divided into eight equal sized pieces of cake and labeled with the word ”antibiotics”. You should not streak out primary, secondary, etc. Instead, first cross the plate. Then turn the plate or top in such a way that the tops move in a circle across the entire plate, from the outside in. The whole plate should be covered by the bacterial suspension. It’s good if you do whit some speed, and you should not dip the tops into the bacterial suspension again. Then it would be far too much bacteria. Put the lid on the agar plate and place it upside down to prevent condensation on the lid. Do the exact same thing with your positive control, that is, the plate labeled ”without antibiotics.”

Put the first substance you want to test into the mortar and crush it carefully so that liquid comes out. If it is a solid, such as bark, you may need to add distilled water. Add as little as possible so that the concentration of the substances in the bark, for example, remains as high as possible.

Then use a tweezer to take up a disc (as you did before using coffee filters). Dip the disc into the liquid contained in the mortar and then place the disk in the right part at the agar plate. Make sure the disc is drained in the right subject and placed on the piece of the agar where the name of the subject you are testing is written. Wash out of the mortar properly, take the next subject, and do exactly the same thing with it. Continue until all eight discs are placed on the agar plate that you have divided into eight pieces.

Leave the plate down for a few minutes to allow the discs to get firmly attached to the agar. Then place the agar plate in the incubator again, standing upside down. Grow for 12 hours in the incubator, adjust the time as needed. The other agar plate without blood should go into the incubator as it is. Without bacteria. It is your negative control to ensure that you have not contaminated the test.

Create a database for documentation

Create a database in your computer, for example in the software Excel. Register all your samples there, with dates, names and coordinates. Also, create a special folder for your photos. Mark each photograph with such as date and number, in such a way that the photo is linked to the correct sample in the database before stopping it in the folder.

Remember to document all results, not just those that prove that a biological substance has antibiotic effects. Negative results should also be documented.

Check the plates. Make sure that the agar plate that is your negative control is clean. Then you can throw it away. Obtain the agar plate that you placed the discs on. Make sure that bacterial colonies are formed on the plate. Look carefully at the discs. If there is a clear surface without bacteria around any of the discs, take the ruler and measure the diameter of the clear surface across the discs. Register the result in your database. Enter the measurements in millimeters.

When you found something

Once you have found a plant or other that acts as antibiotics (you see a clear zone around the disc with the juice from your biological substance) you must try it several times. Prove that it was not a coincidence that made it look as if the plant is germicidal. And then it is advisable to determine the MIC value.

And think of CUDOS – share your research results!

Källa/Source:

Forslund, T. Antibiotikaresistens. Laboration. Linköpings Universitet. Oktober 2014.

Diy-bio. For DIYbio & Biohackers. 2017. Detta är en riktig stjärna till källa för oss som vill bygga labbutrustning och labba hemma!!! Så kolla gärna in länken.

One comment on “DIYProject: Help Discover New Antibiotics through Citizen Science

  1. Pingback: MIC-värdet (The MIC value) | Biomedicinsk Analytiker

Kommentera

Fyll i dina uppgifter nedan eller klicka på en ikon för att logga in:

WordPress.com Logo

Du kommenterar med ditt WordPress.com-konto. Logga ut / Ändra )

Twitter-bild

Du kommenterar med ditt Twitter-konto. Logga ut / Ändra )

Facebook-foto

Du kommenterar med ditt Facebook-konto. Logga ut / Ändra )

Google+ photo

Du kommenterar med ditt Google+-konto. Logga ut / Ändra )

Ansluter till %s

Information

This entry was posted on 8 juli, 2017 by in D.I.Y., Forskning and tagged .
%d bloggare gillar detta: