DIYProject: Help Discover New Antibiotics through Citizen Science

Det finns ett kul forskningsprojekt som pågår över hela världen just nu, och som vem som helst kan delta i. Målet med projektet är att hitta ny antibiotika (du screenar efter antibiotika), och det behövs ju verkligen med tanke på all resistens som utvecklas. Projektet heter DIYProject: Help Discover New Antibiotics through Citizen Science. Just det här med ”citizen science” gör det riktigt kul. Det här gör man nämligen hemma!

Det går att beställa små färdiga kit på nätet, som du kan använda. Du går ut i naturen och plocka på dig blad, rötter, bark, jord, insekter, blommor, svamp eller vad man nu vill.  Dessa krossas och placerar på en agarplatta med bakterier. Sedan testar du om det man har plockat har någon dödande effekt på bakterierna.

Jag kommer inte att beställa något kit. I stället kommer jag att – med mina kunskaper som legitimerad biomedicinsk analytiker – bygga upp labbet jag behöver här hemma och sedan utveckla ett standardiserat sätt att arbeta. Resultatet kommer att sparas i en databas, och självklart delar jag med mig av resultatet här i bloggen (CUDOS).

Här kommer ett arbetsexemplar av en blivande metodbeskrivning, så som jag har tänkt mig det hela. Men om du vill göra det här själv, i ditt eget biolabb så kommer du att behöva göra justeringar. Den här metodbeskrivningen är ofullständig och mer tankar om hur jag vill ha det. Den fullständiga metodbeskrivningen delar jag med mig av när jag har något material att presentera, i form av en uppsats. Se den här metodbeskrivningen som ett exempel till för att väcka fler tankar och idéer.

Metodbeskrivning

Material

  • Spektrofotometer (bygg själv, köp eller låna), 1 st
  • CAD-program (finns gratis på Internet), 1 st
  • Kaffefilter, 1 pkt
  • Hålslagarapparat, 1 st
  • 3D-skrivare (bygg själv, köp eller låna), 1 st
  • Färskt blod från ett slakteri
  • Agar-agar
  • Natriumklorid (salt)
  • Mörk choklad alternativt trypton i form av kosttillskott
  • 100 mL kranvatten
  • 5 st. petriskålar (per tillfälle)
  • Bakterier från prov (feaces, urin, hals eller liknande)
  • Tre platinöser
  • Inkubator
  • Vattenfast penna
  • Plastpåsar med ziplås
  • Kamera
  • Mobiltelefon med GPS-system, eller GPS
  • Plockat material från naturen
  • Provrör
  • Rörställ
  • Mikropipett
  • Pipettspetsar
  • Ev. vortex
  • Örontops
  • Mortel
  • Pincett
  • Destillerat vatten
  • Fysiologisk natriumklorid
  • Linjal
  • Dator, med Excel eller annat program där du kan skapa en databas

Metod 

Förberedande

Detta kan göras flera månader innan du börjar labba dag 1, eller dagen innan. Men se till att göra det innan laborationerna börjar. Läs många vetenskapliga artiklar på temat antibiotika och biologiskt material hämtat från naturen. Frågor du bör söka svar på är:

  • Finns det en viss typ av växter som brukar ha antibiotisk effekt? Vad bör du titta efter när du letar växter och sådant?
  • Vilka växter är redan testade?

Gör en inventering av vilken utrustning du har och vad du inte har.

  • Jag kommer att behöva bygga klart och kalibrera spektrofotometern mot en spektrofotometer som används kliniskt.
  • I min dator har jag redan ett CAD-program som är gratis, det heter Strata Design 3D SE 7.  Jag måste lära mig hur det fungerar och rita en platinös i programmet.
  • Platinöserna skrivs ut på någon av MakerSpace 3D-skrivare. (Annars går det ju bra att köpa platinöser via nätet, och då slipper du både CAD-programmet och 3D-skrivaren. Jag gör mina egna platinöser bara för att jag kan och tycker det är kul).
  • Köp kaffefilter. Ta ett kaffefilter och använd hålslagarapparaten till att få fram små ”diskar.” Samla ihop diskarna i ett förvaringskärl med lock.
  • Köp allt annat som behöver köpas enligt listan över material som behövs för laborationen.

Nu till det här med bakterien och valet av denna.

  • Bestäm dig för vilken bakterie du vill testa och håll dig till den hela tiden. Du kan naturligtvis testa många olika typer av bakterier, men det gör hela laborationen mycket mer kostsam, tidskrävande och komplicerad eftersom du i så fall ska hålla dig till alla de bakterier du valt. Jag skulle hålla mig till en enda bakterie tills jag hittat något som kan vara en antibiotika, bekräfta resultatet och sedan utöka testningen till fler typer av bakterier. Eller så fixar man en cryobank (kanske enklast) alltså små rör så att man kan ha tex 100 små rör i en liten låda i frysen. I varje rör en sorts bakterie. Bakterierna vilar utan att föröka sig i frysen. När du behöver bakterier, ta fram önskat rör (som innehåller önskad bakterie), tina den i handen på 1 minut, pipettera ut lite bakterier och in i frysen med röret igen. På det viset kan man ha 100 arter hemma.
  • Kontrollera att bakterien du använder inte är resistent. Det gör du genom att odla fram den på lämplig agarplatta, och sedan gramfärga den, ta ett oxidas- och ett katalastest och kanske göra en jästningsserie i rör. Sedan testar du bakterien mot samma typer av antibiotika som redan används ute på marknaden mot just den bakterie du valt. Antibiotikadiskar finns att köpa online. Kontrollera att det klara området runt disken är så stort eller så litet som det ska vara för varje enskild antibiotikadisk.

Och så skapar du ett referensintervall för antibiotikan.

  • Ta reda på MIC-värdet (minsta inhibitoriska koncentration) för varje typ av antibiotikum som du hade på diskarna när du testade resistensen. Skriv in värdet i en tabell. Testa sedan MIC-värdet för några av de växter som har känd antibiotisk verkan (enligt de vetenskapliga artiklar du läst, tex vitlök). Det gör du för att skapa ett referensintervall. MIC-värdet för vitlöken är ditt höga värde, och MIC-värdet för antibiotikan som redan finns ute på marknaden är ditt låga värde. Ju lägre desto bättre. Lägre koncentration av antibiotika som dödar alla bakterier betyder ju att antibiotika är mer effektiv. Om du hittar en planta med samma MIC-värde som vitlök, då vet du att visst den har antibiotisk effekt, men inte så mycket. Om du hittar en planta med ungefär samma låga MIC-värde som den antibiotika som finns ute på marknaden då har du hittat något som kan fungera som antibiotika! Och om du skulle hitta en planta som har ett ännu lägre MIC-värde än antibiotikan som finns ute på marknaden, då har du hittat något riktigt stort! Om du vill vara ambitiös räknar du alltid ut MIC-värdet för allt du hittar som har antibiotisk effekt och gör ett diagram över det.

Dag 1; Tillredning av agar, hopsamling av bakteriellt prov och utodling på blodagarplatta

Den första dagen ska du göra två blodagarplattor; och du ska odla ut ditt prov från feaces, urin eller hals på en av dem. Den andra plattan är din negativa kontroll. Båda plattorna ska odlas i inkubatorn.

Ta fram två petriskålar och placera dem på ett rent ställe intill platsen där du ska koka ihop agarn. Börja sedan med att koka ihop agarn. Ta fram färskt blod som du fått från slakteriet, agar-agar, natriumklorid, köttextrakt, kranvatten, mörk choklad alternativt trypton i form av kosttillskott, en våg, en liten tallrik, en stor sked och en kastrull i lämplig storlek. Mät upp 100 mL vatten i en bägare eller ett rent glas. Placera sedan den lilla tallriken på vågen och tarera bort dess vikt. Väg sedan upp 1,5 g agar-agar, 0,5 g natriumklorid samt 0,8 g köttextrakt. Häll det i kastrullen och använd dig av kranvattnet till att skölja ner allt från tallriken till kastrullen. Blandningen värms på spisen under omrörning tills dess att agarn är homogen. Blanda ner 5 – 10 % blod i kastrullen, tillsammans med mörk choklad alternativt trypton i form av kosttillskott. Rör om tills blandningen åter igen blir homogen. Nu är blodagarn färdig.

Ta dina två petriskålar och märk dem på undersidan med hjälp av den vattenfasta penna. På den ena skålens baksida skriver ”utodling.” På baksidan av den andra petriskålen skriver du ”negativ kontroll”. Genom att markera petriskålarna blir det lättare för dig att hålla isär dem och inte blanda ihop dem. Det är särskilt bra om något skulle gå fel under laborationen och resultater inte blir som du har tänkt dig. Sådant händer med jämna mellanrum. Häll den varma blodagarn i de två petriskålarna. Lägg locket på agarplattorna och placera dem i kylen så att de får stelna.

När de har stelnat; Använd platinöserna och stryk ut ett prov (feaces, urin, eller halsprov) innehållande bakterier på den blodagarplattan som du markerat ordet utodling. Du ska göra ett primär-, senkundär, tertiär och kvartärutstryk.

Placera sedan blodagarplattan tillsammans med den andra rena blodagarplattan som du markerar med ”negativ kontroll” i inkubatorn. Den rena blodagarplattan är din negativa kontroll. Odla båda plattorna i 8-12 timmar i inkubator, justera tiden efter behov.

Dag 2; eventuellt renodling, insamling av biologiskt material, utodling på nya agarplattor och preparering och utplacering av diskar

Den andra dagen ska du göra en ny agar, kontrollera agarplattorna du placerade i inkubatorn den första dagen och antingen göra en renodling eller två nya agarplattor utan blod. Om den negativa kontrollen är ren och du inte behöver göra någon renodling kommer du få plocka växter i naturen, tillreda dem, göra en bakteriesuspension, odla ut den på ny platta på vilken du placerar diskar indränkta i saften från växterna du samlat. Agarplattorna odlas i inkubatorn.

Om kontrollen är kontaminerad

Börja med att kontrollera om den rena blodagarplattan som du markerat med ”negativ kontroll.” Om den inte är det har du kontaminerat plattorna, du ska fortfarande slänga den med du måste börja om från början med dag 1. Du måste vara noga med vilken bakterie du testar, använd alltid samma bakterie eftersom olika bakterier är olika känslig mot olika typer av antibiotika.

Plattan är kontaminerad. Börja om från början med hela laborationen.

Om kontrollen är ren

Om kontrollen är ren betyder det att du lyckats att hålla dina prover rena. De är inte kontaminerade.

Den negativa konstrollen är ren, alltså inte kontaminerad. Bra, du kan fortsätta med nästa steg i laborationen.

Nu kan du slänga den innan du också kontrollerar blodagarplattan du markerat medutodling och odlat ut ditt prov på. Du ska se bakteriekolonier. Om du har möjlighet är det till stor fördel om du kontrollera vilken bakterie du har på plattan genom knufftest, gamfärgning, eventuellt katalastest, oxidastest och jäsningsserie i rör. Ett knufftest kan du alltid göra, och försök åtminstone beskriva bakteriekolonierna; hur ser de ut i färg och konsistens, vad luktar de? Svärmar de eller inte? Har de orsakar någon hemolys på plattan? Vilken typ av hemolys är det i så fall? Kan du utifrån det ana vad de är för bakterie? Vilken bakterie är den mest troliga, med tanke på varifrån provet tagits? Behöver du göra en renodling?

Om du behöver göra en renodling

Om du behöver göra en renodling tar du fram en ny petriskål. På baksidan av den skriver du ordet ”renodling.” Gör en ny agar, men räkna ut hur mycket du ska använda av varje ingrediens. Du ska ha agar till en enda petriskål. Häll agarn i petriskålen och låt stelna i kyl.

När agarn har stelnat tar du fram den. Plocka också fram blodagarplattan med bakteriekolonierna ur inkubatorn. Titta väldigt noga på kolnierna. Vilken av dem är du intresserad av att isolera? När du bet vilken bakterie du vill ha tar du en platinös och vidrör kolonin du vill ha med den. Gör sedan ett primär-, sekundär, teritiär och kvartärutstryk över din nya blodagarplatta.

Placera den i inkubatorn och odla i 12 timmar och justera tiden efter behov. Efter att plattan odlats i inkubatorn måste du ta fram den igen, och avgöra om du behöver göra en ny renodling eller inte.

Om du inte behöver göra en renodling

Om du bara har en enda bakterieart på din blodagarplatta och inte behöver göra någon renodling tar du fram tre nya petriskålar. Markera dem på undersidan med den vattenfasta pennan; den ena skålen med texten ”antibiotika”. Sedan drar du fyra raka streck över botten på petriskålen på ett sådant sätt att plattan delas upp i åtta lika stora tårtbitar. I varje tårtbit skriver du namnet på de sex biologiska ämnen som du vill testa; ett biologiskt ämne i varje tårtbit. Den andra petriskålens botten markerar du med texten ”negativ kontroll” och den tredje skålen markerar du med texten ”utan antibiotika”.

Syftet med detta är att på plattan märkt ”antibiotika” ska du testa de biologiska material du har samlat på dig, för att se om detta har någon antibiotisk effekt. Plattan märk ”negativ kontroll” är din negativa kontroll precis som ovan; den ska du titta på för att vara säker på att du inte har kontaminerat provet med något. På plattan märkt med orden ”utan antibiotika” ska du odla ut bakterier, men inte tillsätta något biologisk material. Om resultatet av laborationen blir bra ska den plattan vara full med bakterier. Om den inte är det kan du räkna med att något har gått fel. Även om plattan där du testar det biologiska materialets antibiotiska effekter är ren kan du inte dra slutsatsen att materialet fungerar som antibiotika. Nej, det kanske är så att inkubatorn inte fungerat på rätt sätt och att bakterierna inte kunnat tillväxa helt enkelt. Då får du börja om med detta steg och göra nya agarplattor utan blod, och en ny bakteriesuspension från blodagarn som du sparade. Plattan som kallas för ”utan antibiotika” kan lika gärna kallas för positiv kontroll.

Nu när du har märkt de tre plattorna med ”antibiotika”, ”negativ kontroll” och ”utan antibiotika” ska du göra en ny agar i lämplig mängd på samma sätt som tidigare, men utan blod, choklad eller trypton. Häll agarn i de två nya petriskålarna och låt stelna i kyl.

Medan agarn stelnar i kylen ska du gå ut i naturen. Ta med kamera, penna, plastpåsar med ziplås och kniv. Gå ut i naturen och hitta det du vill plocka. Innan du plockar det, ta två fotografier. Ett foto ska föreställa platsen där du plockar. Det andra fotografiet ska tydligt visa det du plockar. Sedan plockar du det vars antibiotiska egenskaper ska testas. Hitta minst åtta olika växter/svampar eller annat, eftersom det finns plats för åtta ämnen på agarplattan och det är både dyrt och kräver jobb att göra samt odla en agarplatta.

Olika bär ute i naturen kan plockas, krossas och testas för sin eventuella antibiotiska effekt.

Placera varje sak du samlar i en egen plastpåse med ziplås. Skriv på påsen dagens datum, vad det är du har plockat, samt på vilken plats du befinner dig i detalj (skriv gärna koordinaterna om du har, du kan exempelvis se koordinaterna på din mobil eller GPS). Du dokumenterar så här noga för att du ska kunna komma tillbaka till exakt samma ställe igen, när du har hittat något som skulle kunna bli en ny antibiotika i framtiden. Då kommer du behöva hitta exakt samma växt igen. Det du skriver på påsen kan se ut så här:

2017-07-08. Maskrosblad. 59°17′37″N, 18°4′59″E

Tänk på att det finns flera koordinatsystem, bestämd dig för vilket du vill använda dig av och håll dig till det.

Gå hem. Gör fysiologisk natriumklorid genom att blanda natriumklorid med destillerat vatten i en bägare (eller ett rent glas från köket). Ställ undan den fysiologiska natriumkloriden till senare, exempelvis på bordet bredvid dig. Ta fram ett provrör och ställ det i ett rörställ. Skriv ”bakteriesuspension” på det.

Märk rören korrekt och ställ dem i ett rörställ.

Ta fram de tre agarplattorna utan blod från kylen, plattorna som du märkte med orden ”antibiotika”, ”negativ kontroll” och ”utan antibiotika”. Ta fram blodagarplattan med bakteriekolonier ur inkubatorn, ställ den upp och ner. Den ska stå upp och ner så att kondens inte bildas i locket på agarplattan. Pipettera ner 500 uL fysiologisk natriumklorid i provröret du märkte med ordet ”bakteriesuspension.” Ta med hjälp av en platinös några bakterier från blodagarplattan och placera dem i röret med fysiologisk natriumklorid. Blanda väl (helst vortexa). Kontrollera koncentrationen av bakteriesuspensionen med hjälp av spektrofotometern. Suspensionens optiska densitet bör ligga mellan 0,3 – 0,6. Blanda eller vortexa bakteriesuspensionen väl en gång till.

Ta en tops, doppa den i bakteriesuspentionen och gör ett utstryk över agarplattan utan blod, den platta som du delat in i sex lika stora tårtbitar och märkt med ordet ”antibiotika”. Du ska inte göra utstryket primärt, sekundärt osv. I stället ska du först göra ett kryss över plattan. Sedan ska du vrida plattan eller topsen på ett sådant sätt att topsen rör sig i en cirkel över hela plattan, utifrån och in. Hela plattat ska täckas av bakteriesuspentionen. Det är bra om du gör det med lite fart, och du får inte doppa topsen i bakteriesuspensionen igen. Då skulle det bli alldeles för mycket bakterier. Lägg på locket på agarplattan och ställ den upp och ner för att hindra kondens på locket. Gör exakt samma sak med din positiva kontroll, alltså plattan som är märkt ”utan antibiotika.”

Den röda markeringen visar hur du ska dra topsen som du doppat i bakteriesuspensionen. Men gör det mycket tätare. Hela plattan ska strykas med suspensionen.

Lägg det första ämnet du vill testa i morteln och krossa det noga så att vätska kommer ut. Om det är ett fast ämne som exempelvis näver kan du behöva tillsätta destillerat vatten. Tillsätt då så lite som möjligt, så att koncentrationen av ämnena i exempelvis nävern förblir så höga som möjligt.

Krossa det du vill undersöka i en mortel.

Ta sedan med hjälp av pincetten en disk (som du ju gjorde tidigare av kaffefilter). Doppa disken i vätskan som finns i morteln och placera sedan disken i rätt tårtbit på agarplattan. Se till att disken är indränkt i rätt ämne och placeras på den tårtbit där namnet på ämnet du testar står skrivet. Tvätta ur mortel ordentligt, ta nästa ämne, och gör exakt samma sak med det. Fortsätt tills dess att alla åtta diskarna är placerade på agarplattan som du har ritat tårtbitarna på.

De svarta prickarna föreställer de indränkta diskarnas placering på agarplattan.

Låt plattan stå med botten ner i några minuter, så att diskarna får fastna på agarn ordentligt. Placera sedan agarplattan i inkubatorn igen, stående upp och ner. Odla i 12 timmar i inkubatorn, justera tiden efter behov. Den andra agarplattan utan blod (platta 5) ska du stoppa in i inkubatorn som den är. Utan bakterier. Den är din negativa kontroll för att säkerställa att du inte kontaminerat provet.

Skapa en databas för dokumentation

Skapa en databas i din datorn, förslagsvis i programmet Excel. Registrera alla dina prover där, med datum, namn och koordinater. Skapa också en särskild mapp för dina fotografier. Märk varje fotografi, exempelvis med datumet och nummer, på ett sådant sätt att fotot kopplas till rätt prov i databasen innan du stoppar det i mappen.

Här ser du ett exempel på hur databasen skulle kunna se ut. Det kanske är bra att ta med domän, rike, klass och så vidare också? Vem vet, du kanske hittar flera antibiotikum och ser ett mönster? De kanske tillhör samma fylum? Då kan det ju vara värt att fortsätta leta där… efter mer.

Tänk på att alla resultat ska dokumenteras, inte bara de som bevisar att ett biologiskt ämne har antibiotisk effekt. Även negativa resultat ska dokumenteras.

Kontrollera att agarplattan som är din negativa kontroll är ren. Sedan kan du slänga den. Ta fram agarplattan som du placerat diskarna på. Kontrollera att det har bildats bakteriekolonier på plattan. Titta noga på diskarna. Om det finns en klar yta utan bakterier runt någon av diskarna, ta fram linjalen och mät diametern av den klara ytan, tvärs över disken. Registrera resultatet i din databas. Ange måttet i enheten millimeter.

När du hittat rätt

När du hittat en växt eller annat som fungerar som antibiotika (du ser en klar zon runt diskarna med saften från ditt biologiska ämne) måste du testa den flera gånger. Bevisa att det inte var slumpen som gjorde att det ser ut som om plantan är bakteriedödande. Och sedan är det lämpligt att bestämma MIC-värdet.

Och tänk på CUDOS – dela med dig av dina forskningsresultat!

På den här bilden verkar bakterien vara känslig mot alla tre typerna av antibiotika. Men det är inte helt säkert att det är så; känslighet och resistens har olika värden (olika diameter i millimeter kring disken) beroende på typ av bakterie och typ av antibiotika. Om din disk ser ut så här ska du rapportera resultatet till experterna, exempelvis något företag som utvecklar läkemedel.

Källa:

Forslund, T. Antibiotikaresistens. Laboration. Linköpings Universitet. Oktober 2014.

Diy-bio. For DIYbio & Biohackers. 2017. Detta är en riktig stjärna till källa för oss som vill bygga labbutrustning och labba hemma!!! Så kolla gärna in länken.

Vad tycker du?