VFU2 – Klinisk immunologi och Transfusion

De två första dagarna den här veckan var jag tyvärr sjuk. Både måndagen och tisdagen skulle jag ha sysslat med Autoimmunitet och allergi, och jag kommer att ta igen det vid ett senare tillfälle. De tre resterande dagarna av veckan var jag i alla fall på Cellulär immunologi. Där arbetar man med stamceller, flödescytometri och HLA-typning. På onsdagen läste jag metodbeskrivningar och förberedde mig inför den laboration som skulle göras på torsdagen. Jag ville förstå både metoden och hur jag sedan skulle räkna på resultatet redan under onsdagen. På torsdagen gjorde jag och min klasskamrat laborationen tillsammans. Jag har beskrivit metoden förut (flödescytometri), men man kan ju använda sig av en metod på flera olika sätt om man har förstått själva grundidén.

Själva laborationen gick ut på att göra en lymfocytprofil, alltså att ta reda på hur mycket det finns av olika lymfocyter i patientens blod. Man arbetar då med det antigen som kallas för cluster of differentiation (CD). Vi ville alltså ta reda på fördelningen mellan T-lymfocyter (CD3+), T-hjälparceller (CD4+), cytotoxiska T-celler (CD8+), B-lymfocyter (CD19+) och NK-celler (CD8+ och CD16+56+) i en patients blod. Om man tar reda på det kan man ju få veta om patienten är sjuk och vilken sjukdomar det är (akut lymfatisk leukemi exempelvis), eller så kan man följa upp behandlingen av en sjukdom och se om patientens nivåer av olika blodceller förbättras.

I ett så kallar ”trucount-rör” (rör för sann/korrekt räkning) har man flera tusen flourescensrande kulor. Man har två sådana rör för samma patient, eftersom man tillsätter olika monoklonala antikroppar i rören som ska urskilja de olika cellerna från varandra. Rören blir också en kontroll, skillnaden i räkningen mellan rören får inte vara för stor (man räknar lymfocyter i båda rören). I det ena röret tillsätter man anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 oh anti-CD45. I det andra röret tillsätter man också anti-CD3 och anti-CD45, men också anti-CD19, anti-CD-16+56. Sedan tillsätter man i båda rören blodet från patienten och en vätska som ska lysera erytrocyterna (de röda blodkropparna) så att de inte stör analysen av lymfocyterna. Varje rör har en bestämd mängd kulor (det står på förpackningen hur många det är), och man tillsätter en bestämd mängd antikroppar och blod. I det här fallet fanns det 51 800 flourescenserande kulor i varje rör, vi tillsatte 20 uL monoklonal antikropp och 50 uL helblod. Sedan kör man alltså provet i en flödescytometer.

Från analysen får en biomedicinsk analytiker ett diagram över de olika blodcellernas fördelning. Men – innan man känner till fördelningen måste man själv sätt dit alla gates. Man gatar alltså in de flourescerande kulorna, leukocyterna och lymfocyterna. Då kommer datorn att lyfta ut lymfocyterna i andra diagram, och där måste man också gata fördelningen mellan de olika lymfocyterna. Då kommer datorn att räkna alla blodceller som finns innanför de gates man har satt. Vi tittar på hur det ser ut.

Första röret

Det första röret innehöll anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 och anti-CD45. Analysresultatet ser ut så här:

ett

Vi har en fördelning mellan leukocyter, lymfocyter och kulor (beads). Vi ser alltså leukocyterna inom en gate som jag gjorde, och datorn har gjort dem gröna. Lymfocyterna finns innanför en annan mindre gate och har också fått färgen grön. Kulorna (beads) har färgats röda i diagrammet.

ett

Datorn ”lyfter ut” alla lymfocyter som jag placerade innanför gaten för lymfocyter. De hamnar i ett annat diagram uppdelade mellan CD3-negativa lymfocyter och CD3-positiva lymfocyter (alltså T-celler) så att man skiljer dem från varandra.

ett

Slutligen; här har vi också en ruta över fördelningen av olika T-lymfocyter som alltså alla är CD3-positiva. Längst ner till vänster har vi T-celler som varken är cytotoxiska eller T-hjälparceller, för de är ju negativa för både CD4- och CD8-antigen. De är alltså så kallade naiva T-celler. Längst ner till höger har vi CD3+ och CD4+, det är alltså T-hjälparceller. Längst upp till vänster har vi cytotoxiska T-celler, eftersom de är posiiva för både CD3 +och CD8+. Längst upp till höger har vi slutligen både CD3+, CD4+ och CD8+. Det syns tyvärr lite dåligt på bilden, men den delen av rutan är en del av av de två andra rutorna som innehåller CD3+ och CD8+, samt CD3+ och CD4+. Dessa celler som är blåfärgade i bilden är alltså dubbelt positiva.

Andra röret

Det andra röret innehöll anti-CD3 och anti-CD45, men också anti-CD19 och anti-CD-16+56

två

Först har vi en likadan bild som från det första röret, den beskriver fördelningen mellan leukcyter, lymfocyter och kulor (beads).

två

Nästa bild beskriver, precis som i det första röret, fördelningen mellan CD3-postitiva T-lymfocyter och andra lymfocyter som är CD3-negativa.

två

Här ser vi fördelningen mellan de CD3-negaiva cellera, alltså de lymfocyter som inte är T-lymfocyter. Det är positiva för CD16 och CD56 alltså NK-celler, och de är positiva för CD19 alltså B-celler.

Nu ska vi räkna!

När man har lagt in en gate för de olika blodcellerna i diagrammen kommer datorn att räkna ut hur många det finns av varje sort. Därför är det viktigt att vara väldigt noga med hur man placerar en gate – hela analysresultatet (och därmed också läkarens bedömning av patientens hälsa) beror på om man placerat gaterna rätt. Man får en ruta med siffror över hur fördelningen mellan de olika blodcellerna. Det ser ut så här:

ett
Första röret.
två
Andra röret.

De här siffrorna använder man för att räkna. Nu kan vi alltså räkna ut exempelvis hur många lymfocyter det finns i patientens blod.

Antal kulor i röret / uL prov = antal kulor per uL

(Antal räknade lymfocyter / Antal räknade beads) * antal kulor per uL

Det var 51 800 beads i ett rör, och vi tog 50 uL helblod. Alltså räknar vi ut hur många kulor (beads) det finns per uL blod genom att räkna:

51 800 beads / 50 uL helbod = 1 036 beads per uL

Nu kan vi räkna ut antalet lymfocuter som finns i patientens blod genom att plocka in siffran vi just räknade fram, tillsammans med antalet räknade lymfocyter och antalet räknade beads. Jag använder siffror från det första röret. Formeln för uträkningen ser ut så här:

(10 296 räknade lymfocyter / 5 817 räknade beads) * 1 036 beads per uL = 7700 lymfocyter per uL

På samma sätt kan man räkna ut antalet NK-celler, cytotoxiska celler, T-hjälparceller och så vidare… Testa själv! Hur många T-hjälparceller finns det i patientens blod?

Under fredagen gjorde vi en HLA-typning på vårt eget blod.

Källa: 

Immunologi och transfusionsmedicin. Linköpings Universitetssjukhus. 2016-03-16 till 2016-03-18.

Vad tycker du?