Immunologiska metoder

Det finns en massa olika immunologiska metoder, så som immunoprecipitation där immunoblotting så som western blot ingår tillsammans med elektrofores, eller radial immunodiffusion (RID), och masspkektrofotometri så som HPLC ingår; immunoassay där de olika ELISA-metoderna nämns, sedan finns också immunoflourescens och flödescytometri. Det finns många fler metoder, det är bra att känna till dem. Läs på, titta lite i böcker och vetenskapliga artiklar. Jag tänker inte gå igenom alla metoderna här, men jag förklarar vad metoderna ha gemensamt – vad de går ut på – och så tänkte jag fokusera på en viktig metod som vi också gjorde en laboration på, nämligen flödescytometri.

Immunologiska metoder

Immunologiska metoder är till för att undersöka immunologiska reaktioner, alltså sådana reaktioner som kan uppstå i samband med att vårt immunförsvar aktiveras. Några exempel på vad som kan mätas är hur olika antikroppar har reagerat, eller hur celler har reagerat (exempelvis lymfocyter). Man kan också mäta koncentrationen av cytokiner och försöka ta reda på om det celler som producerar cytokiner och hur många de i så fall är.

Flödescytometri

Flödescytometrin är en viktig metod som används ganska mycket inom vården, när man analyserar blodceller. Du minns säker att blodceller har så kallade cluster of differentiation (CD). Eftersom olika blodceller har olika CD kan man märka in de olika CD med olika flourescens-färger. När man sedan har tagit ett blodprov och vill ta reda på hur många lymfocyter det finn i prover, då kommer maskinen som utför metoden att utföra analysen med två mätmetoder: genom impendansmätning och genom optisk mätning.

Optisk mätning är den primära metoden och innebär att maskiner kommer låta cellerna gå igenom en tunn slang en och en. Tre lampor lyser mot celler från olika vinklar; 0° mäter blodcellens storlek, 7° mäter blodcellens komplexitet och vid 90° mäts blodcellens granula. Ljuset kommer att passera celler olika mycket beroende på hur mycket som finns inne i cellen; alltså om det finns en stor eller liten kärna, mycket eller lite granula och så vidare. Ljuset bryts helt enkelt olika beroende på cellens innehåll. Men ljuset passerar också olika beroende på cellens storlek. Impendansmätning innebär att cellerna en och en utsätts för elektricitet. Hur mycket av elektriciteten som passerar genom celler beror på cellens storlek och hur mycket som finns i den (kärna, granula). När analysen är klar får man ut ett papper som ser ut så här:

FlödKapp

Vi ska titta på vad det här pappret ger för information. Först tittar vi längst upp till vänster, där det finns en del förkortningar och siffror.

FlödKapp

WBC är en förkortning för white blood cell count. Den första siffran, 5,65 är ett absolut tal, alltså inte någon del eller så. Här ser vi att antalet vita blodceller (leukocyter) var 5,65 * 10^9/L i provet. Siffran i den höra kolumnen är däremot i procent. 0,988 % av blodet bestod av leukocyter. Skillnaden på de här siffrorna är jätteviktig att förstå! Tänk om det skulle stå att det finns nästan dubbelt så många leukocyter i blodet; 11 * 10^9/L… men att dessa fortfarande vore 0,988 % av blodet? Det skulle betyda att de andra blodcellerna också ökat i mängd, eller hur.. och vad skulle det i så fall beror på; vad har hänt i benmärden? Men om det också skulle finnas dubbelt så många leukocyter procentuellt sätt, då skulle det kanske vara en leukemi? Här är det också jätteviktigt att titta på referensintervallen – hur många leukocyter ska det finnas i en frisk människa?

Förkortningen NEU står för neutrofiler; det är både de stavkärningar och de segmenterade som räknas med en och samma siffra här. Det fanns 3,30 * 10^9/L neutrofiler, och dessa är 58,5 % av blodet. Och så vidare… LYM står för lymfocyter, MONO står för monocyter, EOS står för eosinofiler, BASO står för basofiler. Nu tittar vi längre ner på pappret.

FlödKapp

RBC står för red blood cell count, man har alltså räknat de röda blodcellerna (erytrocyterna). Dessa är 4,18 * 10^12/L. Och om du tittar i den högra kolumnen står det också RBC men med ett lite o efteråt. Det lilla o:et står för optisk, man har alltså räknar erytrocyterna med två olika metoder. Den ena metoden är impendans, den andra är optisk. Genom att jämföra räkningen med två olika metoder blir räkningen mer säker.

HGB står gör hemoglobin, lägg märke till att enheten ändras till g/L när vi tittar på hur mycket hemoglobin som finns i blodet. HCT är detsamma som hematokrit. Vad är referensintervallen, hur mycket hemoglobin ska man ha i blodet och hur hög ska hematokriten vara?

MCV står för medelcellvolym, MCH är är den snittet av mängden (massan) hemoglobin som finns i alla erytrocyterna, medan MCHC är snittet av hemoglobinkoncentrationen per enskild cell. Alltså, enligt den analysen som är gjord här finns det i snitt 33,1 picogram (pg) hemoglobin i alla erytrocyterna tillsammans, och i snitt finns det 337 g/L hemoglobin i varje enskild erytrocyt. Vad är referensintervallen för MCV, MCH och MCHC?

RDW står för red cell distribution width, detta mäter erytrocyternas storlek och volym tillsammans. Detta värde kan ju påverkas av olika anemier exempelvis. PLT är en förkortning för platelet, som betyder trombocyter alltså det många kallas för blodplättar. PLTo mäts optiskt och PLTi mäts med impendans. Värdena ligger nära varandra, då kan vi vara säkra på att mätningen stämmer. Vad är referensintervallen för RDW och PLT?

MPV står för menar platelet volume, alltså medeltrombocytvolymen. Alldeles intill, i den högra kolumnen står det CD61. Detta är cluster of differentiation nummer 61 som finns på immunologiskt aktiverade trombocyter och det finns inga sådana här vilket är bra, PDW står för platelet distrubition width som alltså måste vara ett tal som beskriver trombocyternas storlek och volym med en enda siffra på samma sätt som RDW beskriver erytrocyternas storlek och volym. PCT slutligen, är en förkortning för prokalcitonin, en inflammatorisk markör. Vad är referensintervallen för MPV och PCT?

Nu ska vi titta på de olika diagrammen. Ett av dem, det diagrammet som visar olika lymfocyter, ser ut så här:

FlödKapp

På Y-axeln har vi storlek, på X-axeln har vi komplexitet. Ju större blodcell desto längre upp hamnar den i diagrammet, och ju mer komplex den är desto längre till höger hamnar den. Blodcellerna sorteras alltså efter storlek och komplexitet. Komplexitet har att göra med hur mycket som finns inne i cellen; basofiler har mycket granula och hamnar längre till höger än monocyterna, men monocyterna hämnar högre upp än basofilerna eftersom de är större än basofilerna. Var skulle du placera lymfocyterna?

På nästa diagram ser vi en uppdelning mellan monoklonala och polyklonala celler, och uppdelningen görs efter lobularitet (på Y-axeln) och storlek (på X-axeln).

FlödKapp

En monoklonal blodcell är en cell som har en enda kärna. Ett exempel är den stavkärniga neutrofilen och lymfocyten. En polyklonal cell är i stället en cell med en cellkärna i flera delar, så som den segmenterade neutrofilen. Lobularitet är detsamma; ju mer lobulär en cellkärna är desto fler delar består den av. Alltså om vi tittar på Y-axeln kommer trombocyten att placeras längst ner, den segmenterade neutrofilen långt upp. Lymfocyten hamnar någonstans emellan. Om vi tittar på X-axeln i stället kommer trombocyten placeras länst till vänster eftersom den är minst, och monocyten längst till höger eftersom den är störst. Om man tittar på både Y- och X-axeln; hur ligger blodets alla celler då i förhållande till varandra?

I nästa diagram sorteras cellerna efter storlek och hur mycket de färgats in med färgen FL3.

FlödKapp

Det är cellernas DNA som färgas in, så ju mer färg (ju mer till höger) desto mer DNA i cellen. Vilka celler innehåller mer DNA och vilka innehåller mindre? Var skulle du placera blodets olika celler, och varför? Nästa diagram visar den optiska mätningen av trombocyterna.

FlödKapp

De två svarta strecken är en gate (det uttalas precis som gate på en flygplats), man säger att man har ”gatat” trombocyterna. Alla prickar som ligger innanför gaten är trombocyter, det som ligger ovanför är para-proteiner och de som ligger nedanför är skräp. Har man mycket som ligger utanför kanske man ska vara orolig, eftersom det kan betyda att trombocyterna är för stora eller för små. Man har gjort den optiska mätningen från två vinklar; 7° och 90°. Näst sista diagrammet är impendastmätning över samma trombocyter.

FlödKapp

Här ser vi trombocyternas volym i förhållande till deras mängd. Det kallas för volymhistogram. De flesta av dem är ganska små. Ju större de blir, desto färre. Megatrombocyter kan man exempelvis få om man har frist på B12 eller folat.

Sista diagrammet visar RNA i retikulocyterna, alltså de omogna erytrocyterna som faktiskt finns i blodet. Retikulocyter saknar DNA, men har RNA eftersom de är omogna. Anledningen till att det inte finns något alls här – ingen linje, inget histogram – är att det inte ingick i beställningen. Man räknar inte retikulocyter normalt sätt, om man inte har någon speciell misstanke.

FlödKapp

Du tittar vi på samma bild igen. Blodet som användes till det här provet togs kapillärt. Till höger har du en ny analys som är gjort på venöst blod. Kan du förklara varför värdena och diagrammen skiljer sig åt som de gör mellan det kapillära och det venösa blodet?

Källa:

Havarinasab, S. Introduktion till flödescytometri. Föreläsning. Linköpings Universitet. 2014-11-11.

Havarinasab, S. Immunologiska metoder. Föreläsning. Linköpings Universitet. 2014-10-05.

Klinisk Kemi. Verksamhetsförlagd Utbildning 2. Universitetssjukhuset Linköping. 2016-02-16.

Nilsson-Ehle P, et al. Laurells Klinisk kemi i praktisk medicin. 9:e upplagan. Studentlitteratur: Lund. 2012.

Shaker Omran, A. Immunoassay. Föreläsning. Linköpings Universitet. 2014-10-14.

Siemens. What is procalcitonin (PCT)? 2016. (Hämtad 2016-02-29).

Vad tycker du?