Realtids-PCR

Under terminen som varit har vi som läser till biomedicinsk analytiker gjort en laboration – och två seminarier – på temat Realtids-PCR. Jag har tidigare beskrivit PCR. Det var konventionell (vanlig) PCR, medan Realtids-PCR skiljer sig ganska mycket från den vanliga tycker jag. Under laborationen skulle vi hitta, bestämma mängden av, och bestämma typ på norovirus i ett patientprov från feces (avföring). Norovirus är det virus som kan ge vinterkräksjukan. Den här varianten av norovirus, som vi hade, bestod endast av rent RNA från viruset. Det var därmed inte smittsamt. Annars är ju norovirus väldigt smittsamt.

Norovirus

Det finns två genomgrupper av norovirus; 1 och 2. Det skiljer sig ganska mycket i sitt RNA, och därför kunde vi använda två olika prober, där den ena proben band till norovirus 1 och den andra till norovirus 2. RNA är ju för resten enkeltsträngat, därför gjorde vi cDNA av det innan vi kunde göra en Realtids-PCR.

Realtids-PCR

För att kunna gör en Realtids-PCR behövs de vanliga ingredienserna: prov, prober, primrar men också flourescens. Fluorescensen markerar produkten, alltså det vi är ute efter att få i resultatet. I det här fallet var det en inbindning mellan provet (RNA från norovirus) och proben vi ville ha. Allt placerades i en tub, och sedan utförde Realtids-PCR-maskinen allting. Resultatet fick vi på en dataskär i form av kurvor och siffror som vi lärde oss att läsa av under ett seminarium.

Resultatet läses av som ett CT-värde. CT är förkortningen för cycle threshold. Styrkan på fluorescensen är proportionell mot mängden av produkten som bildas under en Realtids-PCR. Med Realtids-PCR är det så speciellt att man, till skillnad mot konventionellt PCR, kan se resultatet efter varje PCR-cykel. Om man gör en konventionell PCR måste man ju göra runt 30 cykler innan man har ett resultat, och då är det bara det resultatet man har. Men med Realtids-PCR kan man se resultatet efter varje enskild cykel. CT-värdet är den PCR-cykel då fluorescensen blir starkare än en viss nivå som man bestämt.

Flouroscens (färg)

Under själva laborationen använder vi oss av flouroscensfärgen SYBR Green, men under det påföljande seminariet då vi gick igenom resultaten tittade vi också på ett resultat som kom från en laboration då man använt flouroscensen TaqMan. Syftet med detta var att jämföra dem. Här komemr en kort beskrivning av vad SYBR Green och TaqMan är för något.

SYBR Green

SYBR Green är en flouroscens som binder in till allt dubbelsträngat DNA som finns i Realtids-PCR-maskinen. Det innebär att eventuella primer dimers också blir märkta av SYBR Green, vilket i sin tur innebär att de kommer att märkas i samband med analysen. Detta löser man genom att göra en smältkurveanalys som jag beskriver nedan. Färgen tar åt sig en färg och sänder ut en annan färg.

TaqMan

Den andra flouroscensen, den som vi inte laborerade med, är TaqMan. Den använder sig av primers och flouroscerande DNA-prober som binder till DNA på ett sådant sätt att det inte kan binda fel. Man använder ju två stycken primers, de går åt varsitt håll. Den ena är en forward primer, den andra en reverse primer. TaqMan placerar sig mellan de ställen där de två primrarna möts.

Proberna har två speciella molekyler fastsatta på sig. Den ena är kallas för reporter, den andra kallas för quencher. Det är reporten som är bärare av flourescenssignalen. När reporten och quenchern kommer nära varandra sker något som kallas för flourescens resonance transfer (FRET). Quenchern tar över flourescenssignalen. Reportern klipps sedan bort från proben med hjälp av DNA-polymeras. Nä reporten simmar omkring fritt i lösningen kommer den bort ifrån quenchern, och då ökar signalens styrka.

Resultatet – analysen

Vad gör man med det här, nu då? Det var ju meningen att vi först och främst skulle se om vi kunde hitta något norovirus i proverna, sedan kunna avgöra hur mycket norovirus vi hade i provet, samt om det var genomtyp 1 eller 2. Vi hittade norovirus, det kunde vi se på formen på de kurvor som datorn presenterade. Varje kurva representerar en PCR-cykel. För att avgöra mängden norovirus i provet behövdes någon form av referens, alltså något vi kunde jämför med. Som referens hade vi en spädningsserie av plasmider, vars känd var känd. På det viset kunde Real-Time PCR-maskinen ge oss en standardkurva, och vi kunde avgöra mängden norovirus på samma sätt som man kan avgöra koncentrationen av något med hjälp av en spektrofotometer.

Smältkurveanalys

Man kan kontrollera om fluoroscensen har bundit in till provet som det ska, på rätt sätt om man har använt sig av SYBRGreen. Det görs med hjälp av en smältkurveanalys. En smältkurveanalys innebär att man hettar upp produkten, medan maskinen samtidigt läser av fluoroscensen. Precis som under en PCR-reaktion kommer den dubbelsträngade DNAt att denaturera. När det sker minskar också fluoroscensen. Primer dimers och likandande felaktiga bindningar kommer att separera först, eftersom de är kortare och därför hålls ihop av en lägre energi. Samtidigt kommer de längre produkterna att fortfarande hålla ihop. Detta kommer att synas på kurvan.

Seminariet

Vid ett senare tillfälle hade vi seminariet, då vi gruppvis gick igenom för- och nackdelar med Realtids-PCR jämfört med vanlig PCR, ELISA och serologi., ta reda på och diskutera när det är bra att kunna bestämma mängden av ett virus och inte bara om det är positiv eller negativt, kvantifiering av realtids-PCR på annat sätt än med standardkurvor som vi gjorde på labbet. Hur digital PCR funkar, för och nackdelar jämfört med realtids-PCR, smältkurva: eventuella felaktigheter kan hittas på nukleotidnivå, utan kontaminering.

Fördelen med realtids-PCR är bland annat att man inte behöver odla fram något virus, det går att ha väldigt små mängder eftersom realtids-PCR är med känsligt (det har högre sensitivitet) är vanlig PCR. Man arbetar i ett slutet system, genom att hälla ner alla ingredienser, så det blir mindre risk för kontamination och felkällor.

Källa:

Brooks, G F. Carroll, K C. Butel, J S. Morse, A S. Mietzner, T A. Jawetz, Lelnick & Adelberg´s Medical Microbiolgoy. 26:te uppl. The McGraw-Hill Companies, Inc. 2013.

Nordgren J. Virologi 1. Föreläsning. Linköpings Universitet. 2014-10-26.

Nordgren J. Virologi 2. Föreläsning. Linköpings Universitet. 2014-10-28.

Nordgren, J. Realtids-PCR för detektion av Norovirus. Laboration. Linköpings Universitet. 2014-09-23.

Persin, D H. Tang, Y-W. Nolte, F S. Molecular Microbiology: Diagnostic Principles And Practices. Kapitel 4; Real-Time PCR and Melting Analysis. Skrivet av Wittwer, C T. Kusukawa, NASM Press. 2011.

Vad tycker du?