Western Blot

Under termin 2 beskrev jag dels teorin bakom PCR, dels hur vi gjort en PCR-laboration och dels hur vi fått en visningslaboration i Southern Blot. Den här terminen har vi gjort en Western-blot-laboration. Laborationen var uppdelad på två inte riktigt hela dagar. Det hela gick ut på att skilja proteinet alfa1-antitrypsin från andra proteiner i plasma, och sedan märka in det med en antikropp för att sedan blotta det. Anledningen till att man gör det är att man vill se mängden alfa1-antitrypsin en patient har. Alfa1-antritrypsin är ett akutfasprotein (precis som CRP). Det bildas i levern och transporteras runt i kroppen med hjälp av blodet. Det har till uppgift att skydda våra vävnader mot proteaser som ju bryter ner proteiner, men är också viktigt för en hel del andra uppgifter i kroppen.

Kort och gott kan man säga att den första dagen gick vi igenom det som skulle göras och blandade ihop alla lösningar som skulle komma att behövas under laborationen, vi utförde elektroforesen och förberedde membranen som skulle användas för blotting den andra dagen.

Vi pipetterade ner tre vätskor i trågets brunnar inför elektroforesen: MW 20, blank, a1-antitrypsin, samt plasma (patientprov). Vid själva pipetteringen hade vi redan tillsatt de primära antikropparna. Det fanns också en spårningsfärg eller vad man ska kalla det på svenska (på engelska: tracking dye). Färgen är till för att se det som vandrat över gelén.

FullSizeRender
Gelé efter utförd elektrofores.

Vi arbetade tillsammans två och två eller tre och tre i små grupper, totalt tre grupper. Men de tre grupperna samarbetade också med varandra. Någon grupp gjorde fixeringsvätska åt alla, en annan grupp gjorde tillräckligt med elektrolytbuffert för att den skulle räcka till alla och så vidare. En del vätskor var varje enskilt lite grupp tvungen att göra själva. Redan under den första dagen kunde vi se hur proteinet färgat gelén. Under laborationens andra dag gjordes följande:

  • Sekundära antikroppar tillsattes med antikroppsvätskan.
  • Sköljningar, med TTBS.
  • Framkallning. Vi gick in i universitetets mörkerrum och framkallade en film, eller ett blad, med en bild av proteinet. Nu kunde vi se andra saker på det här bladet än vi såg på gelén. Anledningen till detta är just själva antikropparna. De primära och sekundära antikropparna hade bundit in till proteinet. Det blir alltså skillnad på infärgning med endast Commassie, och inmärkning med antikroppar. Det är säkrare att märka in med antikroppar, man ser mer på det viset.
Wblot RÄTT1
Framkallad film.

 

Sträckan proteinet färdats mättes på gelén. Man mäter då med hjälp av linjalen från toppen på gelén till den plats där proteinet markering börjar. Enheten är millimeter. Därefter beräknades Rf, alltså molekylvikten. Formeln för detta är

Rf = sträckan proteinet färdats i gelén / sträckan spårningsfärgen färdats i gelén.

Vi ritade upp detta i en graf, och satte dit en trendlinje. När grafen var ritad dividerade vi den längd antitrypsinet vandrat med den längd spårningsfärgen vandrat. Svaret på det mattetalet är patientprovets X-värde, (i det här fallet 0,3) alltså patientprovets molekylvikt. Utifrån det kunde kunde vi dra ett streck upp mot trendlinjen och ett till streck mot Y-axeln. Nu visste vi vilket Y-värdet på patientprovet var (4,9).

Wblot RÄTT
På Y-axeln finns det logaritmerade värdet för molvikten, med enhet kDa (kilodata). Y-axelns värde börjar på 4,0. På X-axeln finns Rf-värdet. Den blå linjen visar värdena för vårt patientprov.

Men Y-värdet var logaritmerat, vi var tvungna att räkna igen för att få fram den korrekta molvikten. Vi räknade 10^4,9 och fick 79 433 kDa på patientprovets antitrypsin.

Källa:

Ghafouri, B. Western Blot. Laboration. Linköpings Universitet. December 2014.

Förslag på vidare läsning:

Om du vill kan du läsa mer om Western Blot-tekniken i den vetenskapliga artikeln Western Blot: Technique, Theory and Troubleshooting. Artikeln är skriven av Tahrin Mahmood och Ping-Chang Yang.

Vad tycker du?