ELISA

Immunologi är en vetenskaplig metod, eller egentligen flera metoder, som man kan använda sig av för att undersöka serum. Vad man framför allt undersöker då är hur patientens immunförsvar har svarat på främmande organismer (antigen). I vår kropp produceras det antikroppar/immunoglobulin som svarar på antigen. Det är dessa antikroppar som man kan hitta med hjälp av serologiska metoder. Men det går också bra att identifiera antigen. Metoderna handlar kort och gott om antigen och antikroppar, och en av de metoder som är serologisk och som vi har gått igenom den här terminen är ELISA. Vi har fått både föreläsningar och laborationer på ELISA. Metoden kan bland annat användas för att upptäcka hormonerna T4 och TSH i patientserum, vilket i sin tur kan leda till eventuell diagnos av sjukdom i sköldkörteln. Det var just det vi gjorde på laborationen.

ELISA är en förkortning som står för Enzyme-Linked-ImmunoSorbent Assay. På svenska kan man säga Enzymkopplad Immunabsorberande Analys. Namnet säger en hel del om vad det är, men jag tänkte gå igenom det i alla fall. ELISA kan i sin tur delas in i fyra olika metoder eller sätt som det kan utföras på; direkt, indirekt, kompetativ och sandwich ELISA. Här kommer en kort beskrivning av dem.

Direkt ELISA

Antigen (protein) är fastsatta i botten på brunnarna i en speciell mikrotiterplatta. Man har tillsatt ett annat protein som binder till antigenet i syfte att blockera oönskade inbindningsställen, och sedan tillsätter man en antikropp. Antikroppen är kopplad till ett enzym. Den enzymkopplade antikroppen binder till antigenet som sitter fastsatt på brunnens botten. Man sköljer brunnarna flera gånger i syfte att få bort alla överblivna antikroppar, alltså de antikroppar som inte har lyckats binda till ett antigen. Sedan tillsätter man ett substrat som reagerar med just det enzymet som man bundit till antikroppen. Då bildas det en färg i brunnen. Färgens styrka kommer från enzymet, och styrkan på färgen har alltså att göra med hur mycket enzym som finns i brunnen och därmed också mängden antikroppar och mängden antigen. Man tillsätter en stopplösning som stoppar färgreaktionen i brunnarna, så att den inte kan fortsättet att utvecklas. Därefter läser man av resultatet i en spektrofotometer.

Fördel: Detta är den ELISA-metod som går snabbast att utföra, eftersom det inte är så många moment inblandade. Man undviker också korsreaktioner med sekundära antikroppar (som används i andra ELISA.metoder), eftersom det bara finns en enda primär antikropp.

Nackdel: alla antikroppar måste märkas in med enzymet. Detta kostar mycket, och inte alla antikroppar passar för inmärkning.

Direkt054

Indirekt ELISA

Den indirekt ELISA-metoden liknar den direkta metoden, men med viss skillnad. Den här metoden är en form av sandwich-ELISA, då man lägger antikroppar på varandra som i en smörgås. Antigen sitter fast i botten på en brunn och man blockerar oönskade inbidningsställen. Men till denna sätter man en primär antikropp. Denna antikropp känner igen antigenet och binder till det, men har inget enzym kopplat till sig. Sedan tillsätter man en sekundär antikropp. Den har ett enzym kopplat till sig. Den sekundära antikroppen binder till den primära antikroppen. Naturligtvis tvättar man också bort sådant som inte bundit in, och slutligen tillsätter man det substrat som reagerar med enzymet på den sekundära antikroppen. det bildas då en färg som på samma sätt som i direkt ELISA motsvarar mängden antikroppar och antigen. Man tillsätter stopplösningen innan resultatet avläses i spektrofotometern.

Fördel: Hög sensitivitet eftersom det är två (ibland faktiskt fler) antikroppar som ska binda till ett och samma antigen. Det måste alltså blir rätt på flera ställen. Metoden är också flexibel på det viset att man kan byta ut den primära antikroppen mot andra typer av antikroppar, men ändå använda samma sekundära antikropp.

Nackdel: Det finns risk för korsreaktioner mellan den primära och den sekundära antikroppen.

Indirekt053

Sandwich ELISA

Den här metoden var en av de två metoder som i använder oss av när vi laborerade med sköldkörtelhormonerna. Därför kommer jag att fördjupa mig lite i den här metoden och i nästa metod. Här börjar man med en antikropp som sitter fast på brunnens botten. Sedan tillsätter man patientprovet (serum). I provet finns hormonet TSH, och på det finns en antigen-site. Sedan tillsätter man en andra antikropp som är en anti-TSH-antikropp. Den är alltså riktad mot just TSH, och binder till antigen-siten på TSH. På sin andra sida är den också bunden till ett enzym, i det här fallet pepparrotsoxidas. När man har sköljt bort alla obundna antikroppar tillsätter man substratet TMB som reagerar med pepparrotsoxidas. Det sker en färgförändring, stopplösningen tillsätts och resultatet avläses i spektrofotometern.

Fördel: Hög sensitivitet eftersom det är två antikroppar som ska binda in.

Nackdel: Antigenet (i detta fall TSH) måste ha minst två platser där antikroppar kan binda in.

Sandwich051

Kompetativ ELISA

Även här finns antikroppar på botten av brunnen. Man tillsätter patientprovet som innehåller hormonet fT4, och man tillsätter en antikropp som är bunden både till T4 och till enzymet pepparrotsoxidas. Dessa får sedan tävla om inbidningsstället på den antikropp som sitter fast i brunnens botten. Därav namnet kompetativ ELISA. Sedan sköljer man bort det som inte bundit, och tillsätter substratet TBM som reagerar med enzymet pepparrotsoxidas. En färg bildas. Styrkan på färgen är proportionell mot mängden enzym i provet, och omvänt proportionell mot mängden omärkt fT4 i provet. Ju mer antigen det finns i provet, desto svagare signal.

Fördelar: Hög specificitet (två antikroppar).

Nackdelar: Kräver många steg, längre tid.

Kompetativ052

Källa: 

 Thermo Scientific. Hayworth, D. Overview of ELISA. 2015.

Levinson, W. (2014). Review of medical microbiology and immunology. 13:de upplagan. USA: McGraw-Hill Education.

Wågsäter, D. ELISA Tyroidea. Laboration. Linköpings Universitet. 2014-10-10.

Förslag på vidare läsning: 

AbD Serotec. An introduction to ELISA. 2015.

Center for Precollegiate Education and Training. University of Florida. Learning Module. ELISA testing. 2015.

12 comments

Vad tycker du?