Okända prover: Feaces

Det är fredag, och jag har just avslutat en tre dagar lång laboration på ämnet Okända Prover. Tre dagar innebär två timmar på onsdagen, samt torsdag och fredag förmiddag. Det handlade om bakterier och svamp. Vi arbetare parvis och fick fyra olika patientprover, dessa kom från feaces samt:

Tillsammans med de olika proverna fick vi också fyra olika remisser, där patientens symptom beskrevs. Nu var det våran uppgift att ta reda på vilka bakterier patienten drabbats av. I uppgiften ingick också att göra resistensbestämningar och artbestämningar. Så här gjorde vi:

Feaces-prov

Provet odlades ut på tre olika agarplattor; XLD-agar, Yersinia-agar och Campyagar. Dessa inkuberades över natten i ett värmeskåp, 37 C. De olika agarplattorna fungerar på olika sätt och gynnar olika bakterier.

XLD-agarplattan är både selekterande och differentierande. Normalflora trycks ner, den hindras från att växa. Samtidigt ser man tydligt skillnaden mellan Salmonella, Shigella och övriga gramnegativa stavar. När vi tittade på agarplattorna den andra dagen visade de på rödrosa bakteriekolonier med svart centrum. Det var väldigt svart. Om det hade varit Shigella hade kolonierna istället varit rosa och genomskinliga, med det var de alltså inte. Därför antog vi att provet innehöll salmonellabakterier. Men att bara anta det räckte, naturligtvis inte.

Yesinia-agarplattan är till för att odla en bakterie som heter just Yersinia. Kolonierna blir rosa, med ett mörkare centrum. Men andra tarmbakterier kan också växa här. Om det är något annat än Yersinia som växer på plattan blir bakteriekolonierna lite större med ett rosa centrum, och kanten på kolonierna syns tydligt. Den är inte genomskinlig. Vår yersinia-agarplatta saknade bakteriekolonier helt. Detta stärkte vår misstanke om att bakterierna i feacesprovet skulle kunna vara salmonella.

Campy-agarplattan är till för att odla frram campylobacter. Om bakterien finns kommer agarplattan att få bakteriekolonier som är grå, de flyter ut över plattan på ett svävande otydligt sätt. Men även den här plattan saknade bakteriekolonier helt och hållet. Även detta stärkte vår misstanke om att vi hade att göra med en salmonellabakterie.

Gramfärgning. Vi vet att salmonellabakterien är en gramnegativ stav. Därför gjorde vi en gramfärgning och mikroskoperade bakterien. Det visade sig mycket riktigt att bakterien var en gramnegativ stav, men det finns många bakterier som är gramnegativa stavar. Därför kunde vi ännu inte vara helt säkra på att patienten verkligen drabbats av salmonella. Bakteriee har olika egenskaper, även bakterier som liknar varandra i ett mikroskop. Därför kunde vi använda oss av bakteriens olika egenskaper för att göra fler tester.

Fagkänslighet. Bakteriogfager är virus som bara attackerar bakterier. Olika bakterier har olika bakteriofager. Därför kunde vi utsätta vår misstänka salmonellabakterie för den bakteriofag som angriper salmonellabakterier. Detta gjorde vi genom att odla ut bakterien på en ny XLD-agarplatta.Vi drog ett streck av bakterier över hela plattan, och droppade en droppe av salmonellabakteriens egen fag(suspension) över strecket. Plattan inkuberades i värmeskåp till den tredje dagen. När vi sedan kontrollerade plattan på laborationens sista dag kunde vi se att strecket blir svart, lika svart som bakteriekolonierna på den första XLD-plattan. Platsen där vi droppad fagen skulle bakterien ha utrotats. Tyvärr blev det inte riktigt så. När man arbetar med biologiska prover måste man hela tiden vara kritisk och funderar på att rimligheten i ett analyssvar. Alla prover vi hittills tagit tydde på att det var en salmonella-bakterie. Vår erfarne laborationshandelade tyckte att strecket med bakterier som vi dragit över XLD-plattan var för tjockt och att det var anledningen till det avvikande resultatet. Vi antecknade detta, samtidigt som vi kände oss säkra på att det var en salmonella.

Artbestämning genom jäsningsserie i rör. Detta är ett sätt att avgöra exakt vilken art man har att göra med. Det finns ju flera olika arter av salmonella. Just själva jäsningsserien gjorde vi under en tidigare laboration under termin två. Nu skulle vi alltså göra om det som en del i en större laboration. Samma dag som fagkänsligheten utfördes odlade vi ut bakterien i fyra rör; KIA, Mannit, Urea och Indol/ONPG. Under laborationens tredje dag avlästes resultatet i rören. KIA-röret visade att bakterien fermenterade både glukos och laktos, men att ingen järnsulfid fälldes ut. Mannitröret visade att bakterien fermenterade mannit, men utan gasbildning. Urea-röret visade att bakterien inte bildade någon ammoniak. Indol/ONPG-röret visade att bakterien inte spjälkade galaktosidas och att ingen indol bildades. Men hjälp av en lathund (laborationsinstruktionen) kom vi fram till att bakterien var en Salmonella enteretidis. 

IMG_2314
Artbestämning genom jäsningsserie i rör. De fyra närmsta rören kommer från feaces-provet. Rören längst bak kommer från ett annat prov.

Serotypning är ytterligare ett sätt att artbestämma en bakterie. Och för att vara helt säkra gjorde vi även denna. Alla bakterier har antigen på sin yta. Salmonella enteritidis har O-antigen 1, 9 och 12, H1-antigen G men saknar H2-antigen. Vi placerade bakterien i fyra brunnar, på så kallade tre-bunns-glas. Sedan droppade vi på lite antikroppslösning och vaggade försiktigt tre-brunnsglasen fram och tillbaka i tio minuter. Detta skulle leda till agglutinering, alltså hopklumpning. Vi såg tydligt att O-antigen 9 agglutinerade, men inte H1-antigenet. Vi hade således fått ytterligare ett avvikande resultat. Trots de två avvikande resultaten var vår slutgiltiga slutsats att patienten drabbats av Salmonella enteretidis. 

IMG_2312
Serotypning. Min kollega håller de två tre-brunnsglasen i sina händer och vaggar dem försiktigt fram och tillbaka.

Resistensbestämning. Även detta har vi gjort under den tidigare laboration. För att patienten ska kunna behandlas måste rätt antibiotika tillsättas. För att kunna ge patienten rätt antibiotika måste man veta vilken antibiotika som dödar bakterierna, och vilken antibiotika som inte gör det. Därför odlade vi, under den andra dagen, ut bakterierna på en MH-agarplatta. På plattan sattes också små diskar i en cirkel. De olika diskarna var doppade i olika sorters antibiotika. Plattan inkuberades i ett värmeskåp i 37 C över natten. Den tredje dagen kunde vi tydligt se blanka cirklar runt en del diskar, medan bakterierna växt över en del andra diskar. Med hjälp av en linjal vi mäta diametern i millimeter över varje disk. I en lathund fanns det en tabell som talade om för oss hur många millimeter som krävdes för att bakterien skulle anses vara resistent, känslig eller mittemellan mot en viss typ av antibiotika. De slutade med att vi rekommenderade behandling med antingen Cefotaxim eller TrimSulfa.

IMG_2317
Resistensbestömning av feaces. Klara cirklar av bakteriefria ytor syns runt några diskar. Deras diameter mätter med linjal i syfte att avgöra om bakterien är känslig, resistent eller något mittemellan mot respektive antibiotika.

Laborationen avslutades med att alla laborationspar gjorde en muntlig redovisning inför alla andra. Det här var särskllit intressant eftersom vi allihop hade fått olika patientprover Vi hade olika typer av bakterier, och gjorde därmed olika typer av analyser. Det är lite lättare att komma ihåg det man själv gjort rent praktiskt, men att veta hur man ska göra något som någon annan har gjort är lite svårare. Vi vet redan att Okända Prover kommer på den praktiska tentan som går den 9 december. Vi kommer få analysera olika okända prover, men det finns ju inga garantier på att vi får upprepa just den analys vi själva gjort. Jag kanske måste göra en analys på tentan som en klasskamrat gjort på den här laborationen. Som tur är får vi har laborationsinstruktionen med oss på tentan.

Alternativa lösningar

Nu var det en Salmonella enteretidis vi hittade, men tänk om det varit en annan bakterie? Om vi hade haft tecken på Yersini-tillväxt på Yersinia-agarplattan hade vi gjort andra tester än dem vi nu gjorde. Vi hade fortfarande gjort en gramfärgning, men Yersinia är också en gramnegativ bakterie, precis som salmonella. Det hade inte räckt med en gramfärning. Vi hade behövt gå vidare med artbestämning genom jäsningsserie i rör för att få den exakta arten. Sedan hade vi också gjort en resistensbestämning.

Om det i stället hade funnits tecken på campylobacter på campy-agarplattan hade vi – som med alla andra agarplattor – gjort vår gramfärgning. Det hade visat oss en gramnegativ stav om det varit en campylobacter. Sedan hade vi gjort ett katalastest och ett oxidastest. Campylobakter är nämligen både katalas- och oxidaspositiv. Oxidaser är en typ av ezymer som oxidaspositiva bakterier har. Om man stryker ut några bakteri kollonier på ett filterpapper kan man droppa ett reagens på bakterierna. Man räknar 10 sekunder. Om filtret då har blivit lilablått är testet oxidaspositivt. Ett positivt svar på oxidas- och katalasanalyser skulle leda till att bakterien odlas ut på två nya agarplattor, båda blodagarplattor. Den ena skulle anses vara aerob, den andra mikroaerob. Båda agarplattorna är alltså samma typ av blodagar, men man behandlar dem på olika sätt. Aerob betyder ”med syre” Motsatsen till aerob är anaerob. och anaerob betyder ”utan syre” alltså med koldioxid. I det här fallet placerades den aeroba blodagarplattan i ett värmeskåp med syre, medan den mikroaeroba blodagarplattan placerades i ett värmeskåp med lite mindre syre än vanligt.

Källa:

Forslund, T. Okända prover. Laboration. Linköpings Universitet. 5-7 november 2014.

VetBact. Veterinärmedicinsk Bakteriologi: information om betydelsefulla arter. 2014. (Hämtad 2014-11-17).

Vad tycker du?