Räkna HPLC

Här kommer lite räkning som vi lärde oss på föreläsning av laboration. Det låg ganska mycket tyngd på det här på laborationen, så det känns som att det är viktigt att kunna. För att få bättre förståelse för vad det här handlar om kan det vara bra att först läsa mitt inlägg som handlar om själva tekniken HPLC.

Kapacitet (K´)

K´ är en kapacitetsfaktor. Den talar om hur många gånger längre en komponent (del av en vätska) har befunnit sig inne i den stationära fasen än i den mobila fasen. Formeln för att räkna ut K´ser ut så här:

HPLC084

tR – t0 är detsamma som t´. Det är viktigt att komma ihåg, för vi kommer att använda oss av detta lite senare. Och för att kunna räkna ut K´måste vi känna till retentionstiden, tR. Retentionstiden är den tid det tar för ett ämne att komma ut genom hela HPLC-systemet. Värdet finns nerskriver på datorn, både som en siffra och i grafen. t0 är den tid det tog för ”slasken” (alltså den vätska som först kommer ut ur slangen, men som inte innehåller något intressant) att komma ut i fraktionssamlaren. tR är den tid det tog för vätsan för den graf man vill beräkna K´att komma ut. Om det är den fjärde grafens kapacitet man vill beräkna, då måste man titta på retentionstiden för den fjärde grafen, och byta ut R mot tiden. Om K blir större än 1 innebär det att komponenten varit i den fasta fasen minst lika länge som i den mobila.

Exempel: Vi ska beräkna K´ för en topp. Vi använder oss av de datauppgifter som finns tillgängliga. Retentionstiden för toppen vars K´vi ska beräkna är tR= 16. Retentionstiden för ”slasken” är T0 = 1,5. Vi använder oss av formeln ovan. Beräkningen kommer att se ut så här:

HPLC084

K´ är ungefär 9,7. Det betyder att komponenten har befunnit sig i den stationära fasen 9,7 gånger längre än i den mobila fasen.

Effektivitet (N)

Ju längre tid en vätska går genom kolonnen, desto bredare blir dess kurva. Det är resultatet av olika processer som sker under vandringen. Det finns ett samband mellan kolonnens effektivitet (N) och breddningen på kurvan (W). N är alltså kolonnens effektivitet, och uttrycks som bottental eller antalet teoretiska bottnar. Formeln för att räkna ut tiden för hur länge en vätska vandrat genom kolonnen är:

HPLC084

Wb är bredden på toppens bas. Ett annat räknealternativ som är exakt samma, men som räkna på toppens halva höjd är:

HPLC084

Här är alltså Wh detsamma som halva höjden på toppen. Bokstaven R står i båda talen för resolution, något du kan läsa mer om nedan. En tredje formel är:

HPLC084

Detta är ett teoretiskt tal som inte används. Formlerna ovan bygger på detta tal. Nu tar vi ett exempel: Nu ska vi beräkna bottentalet på den andra kurvan. Vi använder oss av tillgängliga värden från datorn. tR = 6, och t0 = 1,5. Wb = 1,6. Vi använder oss av den första formeln, och när vi har stoppat in värdena ser det ut så här:

HPLC084

N är ungefär 127. Bottentalet är 127. Bottental och teoretiska bottnar är ett statistiskt synsätt på toppen, då man anser att toppen följer en så kallad Gaussfördelning. Det finns fyra olika bredder i en Gaussfördelning. Dessa är:

  • Wj som är toppens bredd vid inflektionspunkten (något datorn tar fram som vi inte behöver fördjupa oss i)
  • Wh som är toppens bredd vid halva höjden
  • W95 som är den plats där bredden på toppen motsvarar 95 % av hela toppens area
  • Wb som är toppens bredd vid basen. Dessa är bredden mellan de punkter där tangenterna till inflektionspunkterna skär baslinjen

Ordet inflektionspunkt är ett matematiskt begrepp. Detta är den punkt där en funktion växlar mellan att vara konvex och konkav, alltså där andraderivatan är noll och byter tecken. Men som sagt var, det är väldigt teoretiskt och inget vi egentligen behöver förstå. 

Selektivitet (α)

α är detsamma som selektivitet. Det talar om hur långt ifrån varandra mitten på två toppar ligger. Formen för att beräkna detta ser ut så här:

HPLC085

Man sätter alltså alltid kapaciteten för kurva med längst retentionstid överst. α bör vara ≥ 1. Om α › 1 föreligger det en baslinjeseparation.

Ett exempel: Vi ska beräkna a1,2, alltså avståndet på mitten av topparna mellan den första och andra kurvan. Vi använder oss av tillgängliga värden från datorn. K´1 = 1,67 och K´2 = 4,33. När vi stoppar in värden i talet ser det ut så här:

HPLC085

a1,2 är ungefär 2,59, det innebär att avståndet mellan mitten av topparna på kurva 1 och kurva 2 är 2,59.

Resolution (R)

Resolution är detsamma som upplösning. Upplösningen talar om hur stor separationen är mellan två olika toppar, alltså om det finns någon baslinje mellan dem och hur stor den i så fall är. Om det ska finnas någon baslinje mellan två toppar måste resolutionen (R) vara minst 1,5. Om resolutionen bara är 1, då är topparna endast åtskilda till 90 %. Resolutionen kan man räkna med två olika formler. Den ena formeln är rent teoretisk, den använder man inte men den andra formeln bygger på den första. Den ser ut så här:

HPLC085

Den andra formeln, som används, är en sammanfattning av värdena för kapacitet (K´), selektivitet (α) och effektivitet (N). Den ser ut så här:

HPLC085

Vi använder oss av värdena från datorn. tR2=12 (alltså retentionstiden för kurva tre), och tR1=8 (retentionstiden för kurva två). Medan bredden på kurva tre är W2 =0,8 och bredden på kurva två är W1=1,6.. Vi stoppar in siffrorna i formeln, och det ser ut så här:

HPLC086

Sammanfattning

Hur bottentalet påverkas

Retentionstiden (tR) påverkar bottentalet (N) genom att en längre retentionstid ger ett större bottental. Retentionstiden står i täljaren, ovanför bråkstrecket. Ju högre det talet är, desto högre måste svaret N bli.

Toppens bredd (W) påverkar bottentalet (N) genom att en längre bredd på toppen ger ett mindre bottental. Bredden finns skriven i nämnare, under bråkstrecket. Ju högre talet är, desto lägre måste svaret N bli. Detta framgår av formeln:

HPLC084

Hur selektiviteten påverkas

Topparnas retentionstid (tR) påverkar selektiviteten (a), eftersom selektiviteten (a) bygger på att man först räknar ut K´, och för att räkna ut K´ måste man känna till retentionstiden (tR). Genom en längre retentionstid i den senare kurvan (täljaren) ökar K´ i täljaren och därmed också svaret selektiviteten (a), medan en längre retentionstid i den första kurvan (nämnaren) minskar K´ i nämnaren och därmed också svaret selektiviteten (a).

HPLC085

Varken topparnas area (A), höjd (h) eller bredd (W) påverkar selektiviteten (α) på något sätt, eftersom dessa inte ingår i någon formel för uträkning av selektiviteten (α).

Hur resolutionen påverkas

Topparnas retentionstid (tR) påverkar resolutionen (R) då en högre retentionstid kommer att leda till en lägre resolution. Topparnas bredd (W) påverkar resolutionen (R), då smalare toppar ger större resolution. Toppens bredd (W) står i ekvationens nämnare under bråkstrecket, och ju mindre det talet är, desto högre blir svaret (R). Även detta framgår av ekvationen.

HPLC085

Varken topparnas area (A) eller höjd (h) påverkar resolutionen (R), eftersom dessa värden inte står att finna i ekvationen.

Kvantitativ bestämning av okänt prov

Detta görs på standardkurva, samt kurvorna från HPLC. Standardlösningen består av naftalen och intern standard. Koncentrationen av naftalen är 0,5 mmol/L. Koncentrationen av intern standard är 1 mmol/L. Det okända provet kommer från vattenverket och innehåller både naftalen och intern standard. mAU för de två kurvorna är 45,245 respektive 298,079 mAU. Beräkna koncentrationen av naftalen i det okända provet. Formel:

Riktningskoefficient = k

Koncentrationen av naftalen = x

Kvoten av höjden på kurvan, milli absorbance unit (mAU) = y

Platsen där linjen skär y-axeln = m.

I det här faller är m noll, så vi bryr oss inte om m. x är 0,5 mmol/L, alltså koncentrationen på ren naftalen är 0,5 mmol/L, men vi vet inte koncentrationen i blandningen. Vi ska räkna koncentrationen av naftalen i blandningen och gör om formeln så här. Vi börjar med att räkna ut y, kvoten av mAU.

y = kvoten av Height mAU.

y = mAU/mAU = 298,079/45,245 = 6,588

y = 6,588

Sedan beräknar vi riktningskoefficienten. x = 0,5 mmol/L, alltså koncentrationen av ren naftalen. Nu gör vi om formeln, den ser ut så här:

k = y/x

k = y/x = 6,588/0,5 = 13,18

k = 13,18

Nu har vi räknat ut riktningskoefficienten, med hjälp av koncentrationen av ren naftalen. När vi räknade tittade vi på värdena från kurvan med ren naftalen. Nu ska vi på värden från kurvan med lösningen som innehåller naftalen. Vi räknar på den okända koncentrationen, den som finns i blandningen, med hjälp av riktningskoefficienten som vi räknat fram. Det är samma formel.

x = y/k

y = kvoten av mAU på den andra kurvan, den med värdena från blandningen. Vi dividerar 109,728 med 44,863 som vi får från datorn.

y = mAU/mAU = 109,728/44,863 = 2,445

Att K är 13,18, det vet vi sedan tidigare beräkning. Nu räknar vi fram x, koncentrationen av naftalen i lösningen.

x = y/k = 2,445/13,18 = 0,185 = 0,19 mmol/L

Bild1Källa:

Carlsson, B. HPLC. Föreläsning. Linköpings Universitet. 2014-09-19.

Carlsson, B. HPLC. Laboration. Linköpings Universitet. Hösten 2014.

Vad tycker du?