HPLC

Vi har haft både en föreläsning, en laboration och en basgrupp som har handlat om HPLC. Det är en förkortning för High Perfomance Liquid Chromatography. På svenska brukar man säga vätskekromatografi. Detta är en laboratoriemetod som används inom forskning och sjukvård. Den är till för att separera olika ämnen ifrån varandra, i syfte att ta reda på hur mycket som finns av ett visst ämne och i vilken koncentration. Det gör man exempelvis när man letar efter alkohol eller droger i blod. Metoden är väldigt automatiserad.

  1. Själva maskinen består av en eller flera vätskor med olika lösningsmedel. Man bestämmer själv vilka lösningsmedel det ska vara, och valet man gör beror på vilka ämnen som ska separeras. Lösningsmedlet och provet kallas tillsammans för mobil fas. 
  2. Det finns också ett membran/filter som tar bort luftbubblor ur lösningsmedlet när det pressas in i maskinen. Men redan innan man använder sig av lösningsmedlet har man oftast fått ut de flesta och de största av luftbubblorna genom att utsätta medlet för ultraljud. Membranet tar bort de mindre bubblorna.
  3. Det är en högtryckspump som pressar lösningsmedlet in genom slangarna, och trycket kan vara oerhört högt. Det är alltid ett jämnt tryck.
  4. Det finns möjlighet att göra inställningar. Om man har fler än ett lösningsmedel kan man ställa in förhållandena mellan de olika lösningsmedlen, alltså hur mycket av vardera som ska tryckas in i maskinen.
  5. Det finns också en injektor. Det är i den som man sprutar in sitt prov med hjälp av en liten spruta; till exempel blodet man vill undersöka.Provet och lösningsmedlet kallas tillsammans för mobil fas. 
  6. Provet och lösningsmedlet rör sig genom en kolonn. Kolonnen är maskinens hjärta, kan man säga. Det är här separationen mellan provets olika delar sker. Temperaturen kan styras i kolonnen. Kolonnen består av ett tunt rör. Inne i det röret finns det små kulor. Dom kulorna sitter fast på rörets vägg, och de är klädda med olika ämnen beroende på vilken typ av separation man vill utföra. Innehåller i kolonnen kallas för fast fas. 
  7. Efter kolonnen finns en detektor. Det är där de olika beståndsdelarna blir avlästa.
  8. De olika värdena skickas till en dator där man kan läsa av resultaten. Resultaten visas som siffror och grafer. Man brukar prata om kurvor och toppar. Resultaten består av värden för bland annat kapacitet, selektivitet och resolution. 
  9. Slutligen kommer de olika beståndsdelarna i hamna i en fraktionssamlare, det vill säga i olika kärl där de separerade delarna ligger i varsitt kärl.

HPLC045

Separation 

Som jag skrev används HPLC till att separera olika delar i en vätska i från varandra, exempelvis alkohol från blod. Detta kan man göra om man har kunskap om hur olika kemiska ämnen är uppbyggda och binder till varandra. Olika molekyler är mer eller mindre polära. Det går att titta på två olika molekyler, jämföra dem med varandra, och på ett ungefär avgöra vilken av dem som är mer eller mindre polär. Men att göra det skulle ta lång tid och kräva en del gissningar. Därför finns det listor som radar upp de olika molekylerna i rätt ordning, i en elutrop serie. Där finns olika polaritetsindex. Vatten hör till de mest polära ämnena, och är hydrofilt (fettavstötande), medan hexan är opolärt och lipofilt (vattenavstötande). Alla molekyler placeras in på olika platser i den elutropa serien. Olika molekyler har också olika storlek och form, och de olika bindningarna inom molekylen har olika affinitet (styrka).

Den här kunskapen använder man sig av när man vill separera ämnen i från varandra. De små kulorna som finns inne i kolonnen kan kläs med olika molekyler som kan vara sura, basiska, hydrofoba eller likna ligander. När man sedan trycket ett ämne genom maskinen sker en separatioon som beror på vad som finns i den mobila fasen och vad som finns i den fasta fasen.

Här kommet ett exempel: Vattnet i olika kommuner har olika hårdhet. Med hjälp av en HPLC-maskin skulle man kunna avhärda vatten, alltså göra det mjukare. Man vill alltså ta bort kalcium ur vattnet. Då kan man använda sig av ett ämne som heter silikat. Det består av kisel och syre, men finns också i natriumform. Det kallas då för natriumsilikat och består bland annat av en natriummolekyl. Det är den här molekylen som är viktig. Man packar kolonnen med natriumsilikat, och så trycker man det hårda vattnet som ska avkalkas genom HPLC-maskinen. Då kommer ett jonutbyte att ske. Natriumsilikatet kommer att släppa ifrån sig sin natriumjon och ta upp en kalciumjon i stället. Jonutbytet kan ske på grund av att natriumsilikatet har fria elektroner med en laddning som drar till sig kalciumjonen. När en fri elektron har fångat upp kalciumjonen släpps en natriumjon i stället. Natriumjonen är en motjon.

Ett annat exempel: Man har en kolonn fylld med en fast fas som är hydrofil. Sedan blandar man vatten och hexan, och trycker ner det i en HPLC-maskinens mobila fas. Vilket ämne kommer ut först i fraktionssamlaren? De hydrofila moleylerna (vattnet) kommer att komma ut i fraktionssamlaren först, och de hydrofoba molekylerna (hexsnet) kommer ut sist. Det beror på att hydrofila molekyler dras till varandra, de håller ihop. De hydrofila vattenmolekylerna i den  mobila fasen kommer alltså att dras till de hydrofila molekylerna i den fasta fasen. De hydrofoba molekylerna stöts bort från den fasta fasens hydrofila molekyler. En separation sker.

Sista exemplet: Kulorna som finns i den fasta fasen kallas för silica-kulor. De är inte helt runda utan har faktiskt små hål i sig, ungefär som hålen/groparna på en golfboll. In i de här groparna kan molekyler diffundera in. De små moleklerna fortsätter ut genom den mobila fasen. Och på det sättet separerar man efter molekylernas storlek. De större molekylerna kommer ut sist.

Källa: 

ALS Life Science. 2014-09-22.

Brunton L L. et al. Goodman och Gillmans The Pharmacological Basis of Therapeutics. Kina: The McGraw-Hill Companies. 2011.

Carlsson, B. HPLC. Föreläsning. Linköpings Universitet. 2014-09-19.

FASS.se

Janson, L W. et al. The big picture. Medical Biochemistry. Kina: The McGraw-Hill Companies. 2012.

Medicinteknisk Förening Dialys. Vattenbehandlingsmetoder. (Hämtad 2014-09-23).

Murray, R K. et el. Harpers Illustrated Biochemistry. Kina: The McGraw-Hill Companies. 2012.

Royal Society of Chemistry. HPLC. Film. YouTube. 2008. (Hämtad 2014-10-07).

2 comments

  1. En föreläsning, en laboration och en basgrupp täcker inte på långa vägar in allt som finns att förstå om HPLC. Fint initiativ att skriva ihop denna text, men tyvärr har flera saker blivit felaktiga. Tror författaren och/eller dennes föreläsare blandat ihop HPLC och GC en smula. T.ex. analyserar man inte alkoholer i blod med HPLC, flyktiga ämnen passar bättre för GC. Kolonnen i bilden och beskrivningen är en GC-kolonn, en HPLC-kolonn är helt packad, inte bara en fast fas på väggarna. En modern HPLC för analytiskt bruk har ingen fraktionssamlare. Det går inte att blanda vatten och hexan, man måste ha en mobil fas som är blandbar. Exemplen verkar försöka beskriva olika former av separation. Vanligast är reversed phase, där man har en polär (vattenlöslig) mobilfas och opolär kolonnpackning, och fångar upp fetare ämnen som fastnar i den fasta fasen. Gammaldagsa straight phase har en opolär mobilfas (t.ex. hexan) och polär kolonnpackning (t.ex. ren silika) och fångar upp polära ämnen. Jonbyteskromatografi används ibland, även om principen för det är den samma som för att avhärda vatten är det inte direkt det man brukar göra med en HPLC. Sista exemplet är gelfiltrering. https://sv.wikipedia.org/wiki/Gelfiltrering. Det är de största molekylerna som kommer ut FÖRST, eftersom de små molekylerna är de som förirrar sig in i de små kanalerna och får längre väg.

    1. Hej Birgitta, och tack för din kommentar. Varken min blogg eller det här inlägget är på något sätt ett försök att ge en fulländad förståelse för HPLC. Bloggen är en beskrivning av hela min utbildning. De enskilda inläggen är en beskrivning av hur jag har förstått föreläsningar, laborationer, mina lärdomar just där och då. Det finns garanterat felaktigheter i bloggen, och jag försöker inte på något sätt hävda något annat. Mina bilder är ofta förenklande, vilket gör det lättare att förstå grunden. Ibland handlar det mer om studieteknik, att komma ihåg. Om du tittar i mitt inlägg om patofysiologiska mekanismer 1 så har jag ritat makrofager som feta (makro) kvinnor med läppstift (hon är fager). Bloggen är mitt sätt att studera. Det är kul, och det ger många studenter inklusive mig själv fin hjälp på vägen. Jag ska titta över dina påpekanden någon gång när jag får tid, men länken till Wikipedia ska vi som ska arbeta/arbetar inom vården låta bli. Eller hur? 😉 I mitt exempel görs en separering av ämnen utifrån storlek på så vis att de stora molekylerna fastnar i silica-kulornas håligheter, men de små molekylerna är för små för detta. De rör sig vidare.

Vad tycker du?