Biomedicinsk Analytiker

Sveriges största site för Biomedicinska Analytiker

Genetiska och molekylärbiologiska metoder

Det finns flera metoder, så kallade genetiska och molekylärbiologiska metoder, som man kan använda sig av som man kan använda sig av som biomedicinsk analytiker i syfte att undersöka mutationer som skett i en persons DNA. Här kommer jag att gå igenom några viktiga metoder. Men först några ord om polymorfi.

Polymorfi

Ordet polymorfi betyder att det skett en förändring av något. I det här fallet handlar det om genetisk polymorfi, vilket innebär att den genetiska koden har förändrats, exempelvis genom mutationer. Detta avser den typ av förändringar som är vanligare än andra. Olika mutationer sker ju oftare eller mindre ofta. Det är lätt att tänka sig att alla mutationer är dåliga för människan, men så är det inte. Det finns dysfunktionella mutationer, dem vill vi inte ha. Men det finns också funktionella mutation. Några exempel på hur funktionella polymorfier kan förändra mutationer av DNA är:

  • Transkription
  • RNA-stabilitet
  • Mängden protein som tillverkas av genen
  • När och var proteinet skapas av genen
  • Aktivitetsgraden av protein

Polymorfier är viktiga därför att om vi kan förändra den genetiska koden, då kan vi också förändra det protein som koden från början var menad att producera. Olika förändringar påverkar olika proteiner. Vid missensemutationer sker en förändring i vilket protein som skapas, en nonsense-mutation skapar ett stoppkodon, om de nukleotider som ersätter de utsprungliga i samband med mutationen är synonyma med de ursprungliga blir det en tyst mutation som alltså inte gör någon skillnad, en ramskiftesmutation skapar en förskjutning.

Polymorfier kan således ge upphov till många effekter. Det kan ge sjukdom, men också naturlig variation. De vanligaste polymorfierna analyseras med så kallade funktionella analyser. Nu kommer jag att gå igenom några exempel på sådana analyser. Många av metoderna kan användas främst inom forskning, men de används också inom rättsgenetiska laboratorier och hos patologen.Ofta vill man hitta så kallade ”riskindivider” inom sjukvården, alltså människor som med anledning av sina arvsanlag löper risk att få en sjukdom. Man vill hitta dessa personer innan de blivit sjuka, så att de kan få den hjälp de behöver utan att lida onödigt mycket och för att svara pengar.

Metoder för experimenell evaluering av polymorfier

FISH är en förkortning för Fluorescenser in situ hybridisation. Metoden går ut på att man vet vilken typ av mutation man söker, hur DNA- eller RNA-koden för den mutationen ser ut (i vilken ordning nukleotiderna sitter). Man använder man sig av prober (nukleotider som man syntetiskt framställer så att den blir så specifik att den binder in i specifikt område på RNA eller DNA), precis som i de olika blottingteknikerna jag beskrivit i tidigare inlägg. Proberna binder till ”sin” bit av RNA eller DNA om den inte är muterad. På ena änden av problem finns en fluorescerande markör som kan avläsa med hjälp av ett instrument eller genom att man tittar på det i fluorescernsmikroskop. Saknas proben när man tittar i mikroskopet betyder det att proben inte har bundit till något DNA eller RNA, alltså kan mutation eller deletion finnas i området, patienten kan vara sjuk. Exempel på sjukdom man skulle kunna hitta på detta sätt är 22q11-deletionssyndromet. Detta är ett samlingsnamn för flera olika syndrom som kan kopplas till  bland annat autism och ADHD.

  • Fördel; DNA-förändringar ses i mikroskop.
  • Nackdel: Man ser bara större DNA-förändringar.

MMP – matrixproteaser, är något som bryter ner substanser i kärlvecken. En hög nivå av MMP innebär högre risk för hjärtinfarkt, generellt sett. Detta beror på en förändring i genen -519 A/G, den är placerad 519 baspar innan startsiten. Där finns ett A eller ett G.

En gen behöver inte alltid översättas till proteiner. Därför kan även proteiner analyseras i jakten på mutationer. Analys på proteinnivå baseras på en gen som man har, man laddar proteinerna i prover så att alla får samma negativa laddning. Proteinerna får sedan vandrar till den positiva anoden i en elektrofores. De kan därmed separeras efter storlek. Sedan kan man ta proteinerna och blotta dem genom elektrisk spänning till cellulosamembran, man gör en Western blot. Man använder sig då av antikroppar riktade mot MMP1, den binder in där på membranet. Tillsätt sekundär antikropp som binder in på enzymet???, detektera med kamera. Western blot tittar på mängden protein, inte deras aktivitet.

Electro mobility shift assay (EMSA) är en metod som används för att studera allelspecifika DNA-kärnprotein-interaktioner. Man kan titta på hur transkriptionsfaktorer binder in i DNA. Radioaktivt inmärkt DNA utgör ett referensprov, alltså det prov man vill titta på för att se om det finns avvikelser. Man gör ett proteinextrakt av celler och låter det binda in till genen. Därefter görs en elektrofores. Om proteinet bundit in till DNA blir det större komplex som vandrar långsammare.

Transient (övergående, ej stabil) transfektion är en metod till för att studera allelspecifik promotoraktivitet. Man vill mäta effekten av en promotor i en heterozygot cell. Man har två celler. Man placerar en plasmid i varje cell, det är olika plasmider, de har olika nukleinsyror. Sedan kontrollerar man deras genproduktion. Metoden ger snabba resultat, men om man har otur kommer det inte mer av en plasmid än av en annan. Med hjälp av den här metoden kan man undersöka hela kromatinet.

HaploChIP är en analys av allelspecifik transkriptionell aktivitet i heterozygota intakta celler. Cellen är heterozygot, den har alltså ett A eller ett C i sin allel. Polymeras binder vid transkription, om man fixerar processen med formalyd, och tillsätter antikroppar som kan binda in till det aktiverade polymeraset. Då kan fragment som har antikroppen fångas upp. Sedan kan man bestämma genomtyp genom att se hur mycket DNA.polymeras som har bundit in till A- eller C-varienterna. Mer DNA-polymeras ger mer transkription.

Formaldehyd-assisted isolation of regulatory elements. Platsen där DNA-polymeraets binder in skapar en öppen yta, tillfälligt. Om man tar ut den där öppna ytan kan man få fram öppna regioner på genen och märka in dem. Sedan sätter man de inmärkta regionerna på ett miccroarray-chip och avläser platsen där kromosomerna är öppna, alltså platsen där  DNA-polymeras kan binda in. Detta kan sedan kopplas till olika positioner på gener. Då vet man var det finns en promotorregion som är kopplad till hög aktivitet.

Källa:

Cunningham, F G. et al. Williams obstetrics. 23:de upplagan. USA: The McGraw-Hill Companies, Inc. 2010.

Wågsäter, D. Genetiska och molekylärbiologiska metoder. Föreläsning. Linköpings Universitet. 2014-02-13.

One comment on “Genetiska och molekylärbiologiska metoder

  1. Pingback: Korrigeringar och tillägg, termin 2 | Biomedicinsk Analytiker

Kommentera

Fyll i dina uppgifter nedan eller klicka på en ikon för att logga in:

WordPress.com Logo

Du kommenterar med ditt WordPress.com-konto. Logga ut / Ändra )

Twitter-bild

Du kommenterar med ditt Twitter-konto. Logga ut / Ändra )

Facebook-foto

Du kommenterar med ditt Facebook-konto. Logga ut / Ändra )

Google+ photo

Du kommenterar med ditt Google+-konto. Logga ut / Ändra )

Ansluter till %s

Information

This entry was posted on 15 augusti, 2014 by in - Molekylärbiologi, Termin 2 and tagged .
%d bloggare gillar detta: