Restriktionsenzymer
Olika sätt restriktionsenzymet klipper på.
Restriktionsenzymer är proteiner med så kallad ”symatisk aktivitet.” Restriktionsenzymerna kan använda DNA som substrat i en kemisk reaktion. Ett substrat är ju det ämne som används för att få något annat. Tänk dig en formel där du har två kemiska ämnen som du blandar, de påverkar varandra och så får du ett annat ämne. De ämnena som du blandar är själva substraten. Som formel skulle det kunna se ut så här:
Substrat + substrat –> annat ämne/något nytt
Med hjälp av restriktionsenzymer kan DNA klyvas i två bitar. Detta sker dock inte precis var som helst, var det sker beror på i vilken ordning nukleotiderna i DNA sitter. Man kan använda sig av den här metoden för att hybridisera (sätta ihop) exempelvis DNA från två olika arter. Metoden kallas för ”klipp och klistra.”
- Man tillsätter restriktionsenzymer till DNA. När restriktionsenzymet hittat rätt nukleotidsekvens binder det in. Där skapar det socker och fosfatkedjor på DNA och det klyvs. Vi har två bitar av DNA.
- Om vi vet hur igenkänningssekvensen där vi vill att restriktionsenzymet ska binda in ser ut, och vilken typ av restriktionsenzym vi ska använda, då vet vi också hur ändarna på det avklippta DNAt kommer se ut. Det kan bli två olika typer av snitt. Om det blir ett rakt snitt kallas det för blunt ends, om det blir ojämn ändar kallas det sticky ends. Olika restriktionsenzymer känner igen olika sekvenser och klipper på olika sätt. Om man får sticky ends kan man sättas ihop ändarna, det är mycket svårare att göra om man har blunt ends. Det är framför allt svårt att veta om blunt ends blir hopklistrade på rätt sätt eller om de hamnat upp- och ner. Klippningen sker också på olika sätt beroende på om genen man klipper i är homo- eller heterozygot. En homozygot gen innebär att genen har två arvsanlag som är lika (exempelvis blåa ögon från både mamma och pappa), medan en heterozygot gen innebär att arvsanlagen skiljer sig åt (exempelvis bruna ögon från mamma och blåa ögon från pappa).
- Det går att tillsätta enzymer som ”limmar ihop” sockret med fosfatkedjorna som restriktionsenzymet skapade på DNAt. Det är ligaser som sätter ihop DNA-bitarna, man säger att de ligerar.
Restriktionsenzymkarta
Man kan kombinera flera olika restriktionsenzymer, separera dem storleksmässigt i agarosgeler, och på det viset skapa vad man kallar för restriktionsenzymkarta. DNA-fragment behandlas med tre olika restriktionsenzymer på en agarosgel, då kommer de olika delarna av DNA att separeras eftersom de vandrar olika långt i gelén beroende på vilken längd de har. Genom metoden kan man avgöra vilket enzym som ger en viss längd på de olika DNA-fragmenten.
Källa:
Brändén, H. (2003). Molekylärbiologi. 3:dje upplagan. Danmark: Studentlitteratur.
Lindqvist Appell, M. Förberedelse inför PCR-laboration. Föreläsning. Linköpings Universitet. 2014-01-25.
Lindqvist Appell, M. PCR. Laboration. Linköpings Universitet. Tre tillfällen fördelade på januari och februari 2014.
Sundqvist, P. Genteknologiska verktyg. Föreläsning. Linköpings Universitet. 2014-01-25.
Pingback: Korrigeringar och tillägg, termin 2 | Biomedicinsk Analytiker