Nukleinsyrahybridisering

Som jag tidigare nämnt är hybridisering en viktig del av PCR-reaktionen, då DNA kopieras. Samma sak sker ju också i kroppen, DNA kopieras under den process som kallas för replikation. I båda processerna ingår hybridisering. Nu tänkte jag därför skriva lite om hybridisering av nukleinsyra som genteknologisk metod.

Till den här metoden behöver vi:

  • DNA
  • Sökfragment/kedja
  • Något som ändrar pH-värdet
  • Ett membran
  • Fosfat 32, förkortas P32
  1. Du vet säkert redan att DNA-strängen är dubbel och hålls ihop av vätebindningar. Om man höjer pH-värdet på DNAts omgivning kommer vätebindningarna att brytas, de denaturerar. I kroppen sker detta med hjälp av enzymet Helikas. I PCR-reaktionen sker det med hjälp av uppvärmning. Det skapar enkla DNA-kedjor som används i reaktionen.
  2. I nukleinsyrahybridisering ser man till att DNA denaturerar genom att höja pH-värdet. Det skapar enkla DNA-kedjor.
  3. Dessa enkla kedjor är nu bundna till ett membran, i just den här metoden som kallas för nukleinsyrahybridisering.
  4. Nu håller man kvar pH-värdet högt, samtidigt som man lägger till så kallade sökfragment, det kan också kallas för en kedja. Kedjan kan vara på 10 eller 11 baspar som minst, oftast är den runt 20 baspar lång, ibland flera 1 000. Dessa är radioaktivt märkta av P32 som utstrålar beta-strålning.
  5. Sökfragmentet binder till den plats på DNA som den passar med. Det beror på i vilken ordning nukleotiderna sitter i DNA och sökfragmentet. Det blir alltså vätebindningar mellan DNA och sökfragmentet. Det är detta som kallas för hybridisering. Ibland leder denna metod till att det skapas en del felaktiga bindningar, så kallade hybrider. De får svagare bindningar eller saknar bindningar helt och hållet. Dessa vill man ha bort, och man får bort dem genom ”tvättning.”
  6. När man tvättar DNA gör man det med en speciell lösning och en liten temperaturförhöjning till runt 40 – 50 grader C. Då får man bort de felaktigt bundna bitarna, medan de som är korrekt bundna blir kvar.
  7. När man är klar finns det en stabil bit DNA kvar, som består av två kedjor som sitter ihop.

Den här metodet är viktig att förstå just eftersom den används som en del i så många andra genteknologiska metoder.

Källa:

Ryan, J K. et al. Sherris medical microbiology. 6:te upplagan. USA: McGraw-Hill Education, Inc. 2014.

Sundqvist, P. Genteknologiska verktyg. Föreläsning. Linköpings Universitet. 2014-01-25.

Vad tycker du?