Southern Blot

Den här terminen har vi hittills gjort fem laborationer; Southern blot, PCR, osmotisk resistens, enzymer, glukos och kreatinin. De har alla tagit en för- eller eftermiddag att göra, krävt en del förberedelser i form av uträkningar av spädningsserier och en titt i KLARA kemikalieregister. Vi måste alltid komma väl förberedda till labbarna, och ska inte behöva räkna på labbet. KLARA ger oss information om de ämnen som ingår i labben fräter, är hälsofarliga eller liknande. Då ver vi vilken skyddsutrustning vi ska använda. Ganska ofta måste vi skriva laborationsrapport efter laborationen, då gör vi det som ett grupparbete. Idag kommer jag att berätta om Southern Blot-laborationen, de andra laborationerna kommer sedan!

Det här var ett visningslabb. Hela basgruppen fick sätta sig runt ett visningsbord och titta på medan delar av laborationen utfördes och förklarades av handledaren. Andra delar av labben visade på powerpoint. Vi hade dessutom läst en hel del teori, och vi skulle redovisa ett flödesschema över metoden innan vi fick se labben utföras. Southen Blot är en metod som används för att ta reda på om en viss del av ett DNA finns i ett prov, och i så fall hur mycket.

  1. Man tar ett DNA-prov och ”klipper” sönder DNA (amplifierar) med ett speciellt ämne (restriktionsenzym) så att att man får just de bitar av DNA som man vill ha. Det tar flera timmar att göra detta.
  2. Sedan utför man en elektrofores; Man för över DNA till små brunnar i en gelé. Gelén ligger i ett tråg (som en vagn eller en skål) under en buffert (en vätska som tål förändringar i pH-värdet), och så sätter man elektroder på tråget. På den sidan där DNA finns är den elektriska laddningen negativt laddad, och på den andra sidan är den elektriska laddningen positivt laddad. Eftersom DNA är negativt laddat kommer det av ”vandra” genom gelén mot den positivt laddade sidan av tråget. De DNA-bitar som är störst rör sig långsammast eftersom de har det största motståndet i gelén. Efter ca 30 minuter har de olika DNA-bitarna flyttat på sig olika långt, man kan se det eftersom DNA är infärgas.
  3. Nu behandlar man gelén (och DNA) med en denaturerande (isärdragande) buffert. Man ser helt enkelt till att det dubbelsträngade DNAt blir enkelsträngat; bufferten påverkar DNA på ett kemiskt sätt så att DNA faller isär. I stället för att vara dubbelsträngat blir det enkelsträngat.
  4. Man lägger ett membran på gelén. Det får DNAt att fästa på membranet. När man lyfter membranet från gelén sitter DNAt alltså på membranet och inte på gelén. Detta kallas för blotting.
  5. Man lägger till en ”prob”. Eller snarare många prober! En prob är en enkelsträngad DNA-bit som man har skapat och märkt med ett radioaktivt ämne. Den biten kommer att sätta sig fast på en annan enkelsträngad DNA-bit som finns på membranet. Men inte vilken bit som helst! Den kommer att leta upp den DNA-bit som stämmer överens. DNA sitter ihop på ett speciellt sätt där bara en bit passar med en annan bit, som i ett pussel. Det är svårt att sätta ihop fel bitar med varandra.
  6. Sedan lägger man membranet i framkallningsvätska. Den färgar proberna på membranet. Då ser man exakt var proberna finns, men man ser inte de andra DNA-sekvenserna som var fel bitar för proberna att fästa vid. För det är ju bara proberna som är radioaktiva, det är bara de som syns i framkallningsvätskan.
  7. Nu vet man precis hur många av de DNA-bitar som fanns i blodprovet som stämde överens med proben. Proben har hjälpt oss att hitta just den DNA-bit vi letade efter. Man kan också se hur stor biten är, eftersom storleken har att göra med hur långt den kom i gelén. Ju mindre biten är, desto längre kom den i gelén, och membranet är ju en kopia av hur DNA låg på gelén. Man kan läggag membranet mot en speciell stege, som en linjal för mätning av DNA. På stegen kan man ser baspars-markeringar. För varje steg ökar antalet baspar med 100. Om DNA-sekvenser ligger på 500-basparsstrecket, då är DNA-sekvensen 500 baspar lång.

I den här visningslabben fick vi se hur tråget för elektrofores sattes upp. Vi fick pipettera ner färg i geléns brunnar, och elektriciteten sattes på. Efter en stund kunde vi se hur färgen börjat flytta på sig. Sedan såg vi hur membranet användes för att flytta över det som skulle vara DNA. På en powerpoint så vi sedan hur resultatet, då de radioaktiva proberna markerar de DNA-sekvenser vi letat efter. Metoden Southern blot kan användas vid exempelvis faderskapstester.

Det är viktigt att komma ihåg att det också finns metoder som kallas för Western blot, och Northern blot. De skiljer sig från Southern blot. Om du vill kan du läsa en laborationsrapport på ämnet Southern Blot. Den är skriven av en elev vid Karolinska Instititet.

elektrofores
Tråg med kablar. Det är i denna som elektroforesen utförs. Metoden används i samband med flera genteknologiska metoder, bland annat också PCR.

Källa: 

Schippert, Å. Southern Blot. Laboration. Linköpings Universitet. 2014-05-02.

Vad tycker du?