PCR

jpg513
Förenklad ritning över PCR – polymerase chain reaction.

PCR, alltså polymerase chain reaction, är en genteknologisk metod som går ut på att öka mängden av det DNA man har. Det är att på konstgjord väg återskapa DNA-replikation. Det kan vara till hjälp om du läser det inlägget innan du läser detta, och kanske också att det är bra att läsa inlägget som handlar om Den centrala dogmen. Men i stället för att den ska ske i kroppen sker den i labbet. Det här är en viktig och grundläggande teknik som används i flera olika syften; att ta reda vems DNA som finns på en brottsplats, att avgöra faderskap, analysera gener, leta efter anlag för sjukdom, fosterdiagnostik eller forskning. Och eftersom PCR är ett sätt att efterlikna DNA-replikation liknar processerna varandra på flera sätt. Här kommer en förklaring till hur PCR går till.

Det material som används är; 

  • DNA. Det kan komma från en patient, från en brottsplats eller liknande. Om man exempelvis har blod måste man rena DNAt så att alla andra delar av blodet, det man inte vill ha, försvinner. Det betyder att man måste slå sönder (lysera) blodkropparna och ”tvätta” bort fetter som kommer från cellmembranet, hemoglobin och sådant. Det här görs på kemisk väg, med hjälp av kemiska reaktioner och en centrifug. Centrifugen trycker ner allt det man inte vill ha genom ett filter, så att det hamnar i botten av röret. DNA finns då kvar i filtret, och sedan kan man tvätta ut DNA ut filtret. Efter hela den här processen är allt man har kvar rent DNA. 
  • Primrar. De är gjorda i labbet och består av rätt oligonukleotider i rätt ordning. Ordet oligo betyder ”relativt få” och en primer är ju ganska kort. När man ska göra en PCR vet man redan vilken del av DNA man letar efter, och därför vet man också hur primrarna ska vara. Om man letar efter en DNA-bit med koden ATT-GCT, då måste man se till att primern sätter sig på en plats att man får med den delen man letar efter. Och eftersom vi har kartlagt hela människans genom har vi koll på var den här biten ska sitt. Här kommer ett försök till exempel:

5´ TAA-GCT-GTA-CGT-ATT-GCT-TAA-TGC  3´ –>

ATT-CGA-CAT-GCA-TAA-CGA-ATTACG  5´<–

Ovanför finns en dubbelsträngad DNA-molekyl. Ändarna är markerade; den övre ändan går från 5´till 3´. Den under tvärtom, från 3´till 5´. Pilarna visar åt vilket håll reaktionen då nytt DNA byggs upp går; alltid från 5´till 3´. Den rödmarkerade koden är DNA-sekvensen vi söker. De blåmarkerade koderna är den kod som primrarna ska ha. De ska ju passa ihop med koden på motsvarande sida. Den rosa koden är den kod som kommer att byggas upp under PCR-reaktionen. Nu har jag bara hittat på de här koderna i den här ordningen, men eftersom vi har kunskap om hur hela genomet ser ut vet vi också i vilken ordning koderna ligger. Det är mindre än 0,5 % av våra gener som skiljer sig åt mellan olika människor. På samma sätt som det finns primrar under replikationsprocessen för att DNA ska kunna byggas upp, på samma sätt måste det finnas primrar här, av samma anledning. Det finns dessutom särskilda regler för hur man bygger en primer: i 3`ändan ska det helst inte finnas fler än tre stycken baspar av G-C, detta eftersom de har den starkaste bindningen till varandra vilket inte är bra om DNA-strängen ska öppnats där. Runt 40-60 % av de mellan 18 och 30 oligonukleotiderna kan vara G-C-kombinationer, inte mer. Dessutom ska man undvika ett T i just själva 3´-ändan, på samma sätt som man också ska undvika miss-matches. Viktigt att komma ihåg är också att det kan uppstå problem om en primer byggs på ett sådant sätt att dess oligonukleotider kan paras med varandra inom själva primern. Då kanske primern viker sig dubbel och binder till sig själv, istället för att binda till DNA. Då misslyckas PCR-reaktionen. Om båda primrarna har kombinationer av oligonukleotider som binder till varandra kommer de båda primrarna att binda till varandra i stället för att binda till DNA, och även då kommer PCR-reaktionen att misslyckas.

  • dNTPs. Detta är fria nukleinsyror som ska bygga den nya DNA-biten. Precis som fria nukleinsyror slängs in i replikationsprocessen när den pågår i våra celler, på samma sätt måste det finnas fria nukleotider i en PCR-reaktion. Vi härmar alltså det kroppen gör. Dessa kommer att simma omkring i lösningen och när de träffar rätt kommer de att fogas samman och bilda DNA. Under translationen, då protein bildas i kroppen, slängs också fria nukleotider in, då i ribosomen. Det är alltså en ganska grundläggande egenskap, detta med fria nukleotider som slängs in och binds samman med DNA-strängen.
  • PCR-buffert. Bufferten som används reglerar pH-värdet under hela processen. Den är till för att underlätta och skynda på PCR-reaktionen. Bufferten hjälper polymeraset att göra sitt jobb, men den kan aldrig ersätta polymeraset. Den innehåller också magnesiumklorid som är ett ytterst viktigt ämne i PCR-processen. Därför har jag, trots att magnesiumkloriden finns i bufferten, skrivit upp den på en egen punkt.
  • Magnesiumklorid. Detta är en mycket viktig komponent av en PCR-reaktion. MgCl2 gör att magnesiumjoner kan frisättas. Koncentrationen av magnesium påverkar både hur effektivt reaktionen går, och hur noga den är. Koncentrationen påverkar också dNTS. Finns det för mycket magnesium, då fungerar inte dNTPs riktigt. Det blir felaktiga bindningar. Magnesiumet är en s.k. ”co-faktor.” Den binder till enzymet så att det blir aktivt.
  • Taq-polymeras. Just denna typ av polymeras, Taq-polymeras, tål lite högre temperaturer, DNA-polymeras gör inte det, det går sönder och är därför inte så lämpligt att arbeta med när man håller på med en PCR-reaktion. Att taq-polymeraset tillsätts reaktionen är också ett sätt att härma det som sker i kroppen. I kroppen är det ju DNA-polymeras som under replikationen tar bort primrarna och ersätter dem med DNA.
  • PCR-maskin. PCR-maskinen sköter hela processen. Den arbetar i cykler där temperaturen höjs och sänks i ett bestämt mönster för att det DNA man har och ska arbeta med kan separeras (denatureras), för att det ska kunna byggas nytt DNA (elongering med hjälp av dNTPs), för att det nya DNAt ska kunna fogas samman på nytt (hybridisera). Detta är en kopia av vad som sker i kroppen under replikationsprocessen.

Så här gå det till: 

DNA extrahera, så att man får det rent. Man blandar det med dNTPs, taq-polymeras, magnesiumkloris, PCR-buffert och primers. Lösningen placeras i en PCR-maskin som lämnas att utföra arbetet under ungefär ett dygn. Under den tiden hinner runt 30 cykler ske.

  • Denaturering: Man har alltså dubbelsträngat DNA som mall. Detta denatureras i PCR-maskinen; dras isär med hjälp av en värme på 94-96 C (i kroppens celler sker det med hjälp av helikas, jmfr. med punkt 1 i mitt inlägg om DNA-replikation). Det är vätebindningarna mellan kvävebaserna som brister; mellan A-T finns två bindinigar, mellan C-G finns det tre bindningar. Vid uppvärmning börjar molekyler att röra på sig, rörelseenergin får vätebindningarna att gå isär, och de håller sig isär utan det där proteinet som under replikationen (punkt 2 i mitt inlägg om DNA-replikation) i kroppen binder till DNA-strängen för att hålla dem i sär. Varför klarar DNA-strängarna att hållas isär utan detta protein i en PCR-maskin? Jo, det är för att man håller temperaturen hög. Den hålls runt 94-96 C i ca 5 min (det är ganska lång tid) första gången man genomgår denna del av processen. Om man denaturerar ordentligt första varvet har man gjort vad man kan för att de ska gå isär.
  • Hybridisering: Temperaturen sänks till 50-65 C. Detta är så kallad inbindningstemperatur, då primrarna tillåts anneala/hybridisera, alltså binda in till DNA-mallen. (Jämför detta med punkt 3 i mitt inlägg om DNA-replikation). Här används alltså temperaturförändring i stället för RNA-primas. Primrarna är konstruerade för att binda ihop och avgränsa ”nålen” alltså den bit av DNA som man söker. Bindningen är den termodynamiskt bästa, vilket innebär minste möjliga energiförbrukning. Det är inte bara primrarna som binder till DNA. Själva DNA-strängen stänger också igen (hybridiserar), men det går inte så snabbt. Strängarna måste leta reda på var de passar varandra innan de kan stänga igen; T ska binda till A, och G ska binda till C. PCR-maskinen sänker temperaturen så att de små vätebindningarna i primrarna kan vinna över rörelseenergin som uppnåddes när temperaturen höjdes. De små primrarna hittar var de kan binda in, och gör det innan själva DNA-strängen har slutits. Det beror på att primrarna är mindre och DNA är större, den rörelseenergi som utvecklades när DNA hybridiserade är så stor att det tar längre tid för DNA att stängas än för de små primrarna att binda.
  • Elongering: Temperaturen höjs till 72 C. Taq-polymeras binder in (jämför detta med punkterna 3 och 4 i mitt inlägg om DNA-replikation) i ena ändan på en primer. Det är den ändan som är vänd mot den andra primern. På andra primern sker samma sak. De båda ”klumparna” av Taq-polymeras går mot varandra, passerar varandra, och fortsätter bort från varandra. De jobbar så långt det bara går med att koppla samman DNA-mallen med dNTPs och på det viset skapa nytt DNA. Temperaturen har att göra med att enzymet har sitt arbetsmaximum vid 72 C, andra enzym kräver andra temperaturer. En fri OH-grupp på 3´-ändan kan binda in i den bas (dNTP) som nu läggs till. DNA-strängen är uppbyggd på ett sådant sätt att det bara är i 3´-prim-riktningen som en DNA-sträng kan växa. Enzymet taq-polymeras binder in och utföra sitt jobb. Det är den fria OH-gruppen som gör att enzymet vet att det ska sitta där.
  • Repetition: Sedan börjar proceduren om igen. Primrarna sitter på en sida och är avgränsande, de sätter en gräns. Fler primrar kommer. Det tar en stund innan primrarna som sitter hinner släppa, på den stunden hinner polymeraset jobba och sätta dit nytt DNA. Enzymets kvalitet mäts i hur många bitar den kan bygga på/tidsenhet. Standard är 60-70 baser/sekund. Det går ganska snabbt. Vi börjar få snuttar som är ganska korta. I cykel tre har vi skapat två produkter som är helt begränsade av primrarna, det är vår nål. Den bildas i cykel tre. I övrigt finns en massa produkter, men nålen finns i cykel tre.

Faktorer som påverkar PCR-processen:

Hur bra PCR-reaktionen blir beror på flera olika saker. Det är viktigt att koncentrationen av de olika ingredienserna är korrekt, antalet baspar som består av G-C i mallen original DNA) kan kräva att temperaturen på PCR-processen höjs eftersom bindningen mellan G och C är starkare och kräver mer energi för att separeras. Om man inte höjer temperaturen kvarstår bindningen, men om man höjer temperaturen kommer det ta längre tid innan hybridisering kan ske när temperaturen väl har sänkts igen. DNA-mallen får vara max 1000 baspar lång. Om den är längre blir produkten av PCR-reaktionen också längre vilket gör hela reaktionen mindre effektiv.

PCR-reaktionen kan ritas upp som en tillväxtkurva, på ungefär samma sätt som kurvan jag ritade i mitt inlägg om cellodling. Så småningom kommer reaktionen till en platåfas då det inte längre bildas några fler ”nålar,” alltså inga fler produkter. Detta beror på flera olika orsaker.Naturligtvis är det så att de olika ingredienserna som används i reaktionen kommer att ta slut med tiden, eftersom de används till att bygga upp en ny DNA-bit. Koncentrationerna av färdiguppbyggt DNA och dNTPs/DNA-mallar kommer att förändras. Någon gång kommer koncentrationen av dessa två att mötas, eller att slå ut varandra. Från början finns det ju bara mallar, primrar och dNTPs (tillsammans med de andra ingredienserna). Med tiden blir det bara mer och mer färdigt DNA och färre och färre mallar, primrar och dNTPs. De kommer primrarna får allt svårare att hitta en mall att vinda till, och chansen att rätt dNTPs ska hitta sin rätta plats minskar också. Även om jag har sagt att TAQ-polymeraset är värmetåligt, så kan även det med tiden försämras på grund av värmen i reaktionen. Så småningom kommer också denatureringen att försämras. Ett ämne som heter pyrofosfater ökar hela tiden under PCR-reaktionen, och när denna koncentration har blivit allt för hög kommer även detta att bidra till att PCR-reaktionen att hämmas.

Källa: 

Brändén, H. (2003). Molekylärbiologi. 3:dje upplagan. Danmark: Studentlitteratur.

Lindqvist Appell, M. Förberedelse inför PCR-laboration. Föreläsning. Linköpings Universitet. 2014-01-25.

Lindqvist Appell, M. PCR. Laboration. Linköpings Universitet. Tre tillfällen fördelade på januari och februari 2014.

Ljungman, A. PCR och designa primers. Föreläsning. Linköpings Universitet. 2014-02-03.

Vad tycker du?