Biomedicinsk Analytiker

Sveriges största site för Biomedicinska Analytiker

Fluorescens och Fluorometri

Glosor

Fluorescens = en process där en molekyl avger ljus efter excitation med ljus

Fluorescera = att emittera (släppa ifrån sig) ljus under fluorescensen

Fluorofor = en molekyl som kan absorbera ljus (alltså energi) och sedan sända ut energin (emittera den) i form av ljus. Den kan alltså fluorescera.

Emission = sker när en molekyl går tillbaka till sitt vanliga tillstånd, och då släpper ifrån sig ljus

Semistabil = molekylen är semistabil när den har anpassat sig på ett sådant sätt att den lägsta exciterade nivån hålls kvar

Fluorometri = att analysera och mäta fluorescens

Fluorescent sond = fluorescent prob. En fluorofor som är gjord för att binda till en speciell struktur eller reagera på speciellt stimulus, exempelis till lipider

Foton = en partikel som består av ljus, alltså är den inte något man kan ta på

Vad används metoden till? 

Genom ett fluorescensmikroskop kan man titta på delar i celler och se hur molekyler fungerar, är uppbyggda och påverkar varandra, hur de reagerar på yttre stimulans vilket också innebär att man kan titta på levande celler och vävnad. Metoden används för forskning och analys, för att utvärdera metoder och kontrollera ett resultat.

Exempel på saker man kan se är hur kalcium förändras i celler, hur mycket DNA eller protein det finns, och var i cellen proteinet finns. Genom att mäta styrkan på ljuset som kommer från preparatet kan man ta reda på hur mycket fluorofor det finns i vävnaden man tittar på.

Utrustning

För att kunna använda metoden behövs en ljuskälla, ett filter för att välja våglängd på det exciterade ljuset, ytterligare ett filter för att skilja det exciterade ljuset från de fotoner som håller på att emittera, samt ett detektionssystem alltså något som är till för att ”se” eller registrera energin.

Man kan använda olika instrument för att mäta fluorescens:

  • En spektrofluorometer mäter antalet celler genom att mäta fluorescensen i en lösning. Den fungerar på ett liknande sätt som en spektrofotometer gör.
  • Flödescytometern mäter mängden fluorescens på varje enskild cell i en population.
  • Fluorescensmikroskopet visar fördelningen av fluorescens i en vävnad eller en cell, eftersom man själv ser ljuset.

Metod

Principen för metoden går ut på att man låter ljuset vandra genom excitationsfiltret, vidare genom provet, in i en dikroisk spegel, genom emissionsfiltret och in i en kamera.  En dikroisk spegel är en spegel som är byggd för att reflektera – skicka tillbaka – visst ljust, och transmittera – skicka vidare – annat ljus. På det viset ser man till att ljuset som hamnar på emissionsfiltret bara är ljust som kommer från preparatet man tittar på; ljus av utvald våglängd.

Faktorer som påverkar

Men det finns vissa saker som påverkar fluorescensen och mätningen av den;

  • pH-värdet
  • mängden fluoroforer
  • ljusets styrka i samband med excitation
  • tiden fluoroforen blir belyst; fluoroforerna förstör med tiden. Detta faktum gör att man kan använda sig av tiden/förstörelsen som ett mått på rörligheten i vävnaden.
  • bakgrundsfluorescens; ex. autofluorescens som är detsamma som den energi som exciteras från molekylerna i preparatet även om det inte vore märkt. Det sker naturligt hela tiden.

Energin hos fotoner – excitation och emission

Bild1

Excitation sker med högre energi på kortare våglängd.

Bild1

Emition sker med lägre energi på längre våglängd.

Det är elektronerna i en atom som exciterar och emitterar. Den energi som de tar upp eller avger är i form av fotoner, detta syns som ljus. Man kan räkna på energin (fotonen) i emitterade elektroner. Det finns en speciell formel för detta, och här är nyckeln för att förstå formelns tecken:

Exciterande energi; hvex

Emitterande foton; hvem

Energin hos den emitterande elektronen är så klart lägre, eftersom fotonen tappar lite av sin energi när den exciterar. Men våglängden bli då istället längre. Det här syns i något som kallas Stoke´s Shift, som skrivs så här;

hvex – hvem = Stoke´s Shift

Med hjälp av Stokes Shift kan man skilja de exciterande fotonerna från de emitterande fotonerna med hjälp av en dator som mäter och ritar upp energin enligt nedan. Det är skillnaden mellan excitationsenergin och emissionsenergin som kallas för Stokes Shift.

flourescens614

Källa:

Holmgren Peterson, K. Flourescens och flourometri. Föreläsning. Linköpings Universitet. 2014-02-08.

5 comments on “Fluorescens och Fluorometri

  1. Pingback: Känsel, syn, smak, lukt, hörsel och balans | Biomedicinsk Analytiker

  2. Pingback: Nervceller, gliaceller och kommunikation | Biomedicinsk Analytiker

  3. Pingback: Cortex cerebri: Lobus parietalis (Parietallob) | Biomedicinsk Analytiker

  4. Pingback: Korrigeringar och tillägg, termin 2 | Biomedicinsk Analytiker

  5. Pingback: Skriftlig tentamen i molekylärbiologi och metabolism | Biomedicinsk Analytiker

Kommentera

Fyll i dina uppgifter nedan eller klicka på en ikon för att logga in:

WordPress.com Logo

Du kommenterar med ditt WordPress.com-konto. Logga ut / Ändra )

Twitter-bild

Du kommenterar med ditt Twitter-konto. Logga ut / Ändra )

Facebook-foto

Du kommenterar med ditt Facebook-konto. Logga ut / Ändra )

Google+ photo

Du kommenterar med ditt Google+-konto. Logga ut / Ändra )

Ansluter till %s

Information

This entry was posted on 25 mars, 2014 by in - Molekylärbiologi, Termin 2 and tagged .
%d bloggare gillar detta: