Viable Count: beräkna antalet levande bakterier i en lösning

viable countHär kommer en förklaring på vad Viable count är, något som alltså dök upp på den praktiska tentan vi hade i måndags. Viable count är en mikrobiologisk metod som används för att en biomedicinsk analytiker ska kunna räkna ut koncentrationen av antalalet viabla bakterier i en lösning. En viabel bakterie är en bakterie som lever och har förmågan att föröka sig, den är livsduglig. Det som kan verka lite knepigt med denna, egentligen väldigt enkla, metod är att du ska räkna baklänges.

Så här gör du en viable count

  1. Du har en bakteriesuspension, alltså bakterier i vätska. Blanda den väl så att lösningen blir homogen.
  2. Späd suspensionen genom logaritmisk seriespädning, till tre provrör (eller så många rör som du vill använda dig av). I det här fallet gjordes spädningen med 100 mL bakteriesuspention, och 900 mL spädningsvätska, i seriespädning om tre rör. Märk rören så att du ser vilken spädning de har; från 10‾¹ till  (i det här fallet)10‾³.
  3. Från varje provrör droppas sedan 100 mL utspädd bakteriesuspension på en agarplatta. Spatla ut det, så att bakteriesuspensionen blir jämnt fördelad över hela agarplattan. Märk agarplattorna på samma sätt som provrören är märkta; från 10^-1 till 10^-3, så att man kan se till vilket rör de olika agarplattorna hör. Kom ihåg dagens datum och kanske ditt namn också.
  4. Lägg agarplattorna i ett värmeskåp, 37 C, och låt bakterierna växa till sig i ett dygn (det kallas för att du inkuberar dem).

Andra dygnet

  1. Ta fram agarplattorna. På agarplattorna finns det nu bakteriekolonier, en koloni för varje bakterie som hamnade på plattan när du spatlade ut suspensionen. Dessa kolonier kallas colony forming units, det förkortas CFU. Ta bort de agarplattor som innehåller mindre än 20 och fler än 200 bakteriekolonier. Anledningen till att du ska ta bort dem är att om det är mindre än 20 kolonier blir resultatet inte trovärdigt, och om det är fler än 200 kolonier blir de svårräknade.
  2. Om du har fler än en agarplatta med mellan 20-200 kolonier, räkna ut medelvärdet av antalet CFU på de tre plattorna och använd den siffran på samma sätt som om du bara räknade från en platta. Notera vilken spädningen är, det som står skrivet på agarplattan. Räkna antalet kolonier. Anteckna på papper. I det här fallet väljer vi agarplattan med 40 bakteriekolonier. Spädningen på den agarplattan var 10^-2.
  3. Nu ska du räkna lite enkel matematik med hjälp av en bestämd formel.

Formeln för uträkning av viable count

Du ska alltså använda en matematisk formel för att räkna. Vi vill veta hur mycket bakterier vi hade i bakteriesuspensionen från början, innan spädningen gjordes. Alltså måste vi, på matematisk väg, höja koncentrationen tillbaka till vad den var i den ursprungliga lösningen. Formeln vi använder för detta ser ut så här:

n * spädningsfaktor * 10 = antal CFU/mL

Bokstaven n är en konstant, alltså en siffra. I den här formeln är n det antal CFU som finns på agaplattan, alltså är n 40 CFU. Spädningsfaktorn fanns skriven på agarplattan, den var 10^-2. Men sedan multiplicerar vi med 10 en gång till. Vi har visserligen bara gjort två spädningar, spädningsfaktorn i den första spädningen var 10^-1. Men vi vill inte veta hur mycket bakterie det var i den spädningen, vi vill veta hur mycket bakterier det var i suspensionen innan vi gjorde den första spädningen. Därför multiplicerar man alltid med en extra tiopotens. Om man stoppar in alla siffror i den här formeln från mitt exempel, så kommer formeln att se ut så här:

40  CFU * 10^2 * 10 = 40 000 CFU/mL suspension.

Lägg märke till att jag har tagit bort minustecknet i spädningsfaktorn. Spädningsfaktorn var 10^-2, men jag räknar med siffran 10^2. Anledningen till det är att jag räknar baklänges. Vi skrev 10^-2 när vi spädde, men nu ska vi räkna ut vad koncentrationen var innan spädningen, alltså tar vi bort minustecknet.

Förenkla formeln

Formeln skulle kunna förenklas genom att vi helt enkelt säger; lägg till en tiopotens när du multiplicerar antalet CFU med spädningsfaktorn som står skriven på agarplattan. Då skulle talet se ut så här:

40 CFU * 10^3 = 40 000 CFU/mL

Det är ju samma sak. Men när du gör en tenta kan det vara bra att skriva allt på rätt sätt, med rätt formel. Lärare vill gärna se och kunna följa hur du tänker.

För- och nackdelar

Precis som med allt annat finns det både för- och nackdelar med metoden. En fördel med viable count är att det bara är de levande bakterierna som räknas, och att det är en väldigt känslig metod. De döda bakterierna gör ju oftast ingen skillnad. En nackdel är metoden måste göras manuellt och det tar tid. Inte minst att inkubera bakterierna på agarplattan. Dessutom är det inte alltid som en bakteriekoloni faktiskt grundar sig på bara en bakterie. Ibland har de klumpat ihop sig. Det är viktigt att komma ihåg detta, då det kan bli fel i värdena. Det är därför kolonierna kallas för CFU, colony forming units. Om du översätter detta till svenska skulle man kanske kunna kalla CFU för koloniformande enheter. Det är en påminnelse om att det kanske är flera bakterier som skapat en koloni… och att du därför kan räkna fel.

Jämför gärna den härmetoden med att använda spektrofotometern. Du an använda den för att räkna ut antalet bakterier i en suspension, men då kommer alla bakterier att räknas. Även de döda, eftersom en spektrofotometer läser av grumligheten i en lösning. I det här fallet blir ju viable count en mer specifik metod.

 Testa viable count online!

Nu kan du testa att gör en viable count online, Kolla in Micro eGuide!

Källa: 

Forslund, T. Odling, mikroskopering och kvantifiering av bakterier. Laboration. Linköpings Universitet. Våren 2013.

7 comments

  1. Hej! På tentan för termin två skrev du att denna metod använder men med en ”knorr”? Vad var denna knorr? 😊

  2. Hej, ett sent inlägg kanske. Anledningen till den extra 10-potensen i formeln, utöver spädningsfaktorn, är väl i detta fall att du har valt att sprida ut 0,1 ml på agarplattan. Därför måste du multiplicera med 10 för att få svaret i CFU/ml.
    Du kunde ju t ex vid ett annat tillfälle ha valt att fördela ut 1 ml på 3 agarplattor. Då räknar man ihop det totala antalet kolonier på de tre plattorna och så har man svaret direkt i CFU/ml. D v s då behöver man bara multiplicera med spädningsfaktorn. Eller har jag fattat fel?

    1. Hej Jörgen,

      Det är aldrig för sent att kommentera ett inlägg 🙂 Men det är alltid bäst att odla ut på fler agarplattor, efterom man får ett säkrare svar då. Jag odlade ut på en agarplatta i det här exemplet för att göra det lite lättare att förstå. Om du odlar ut på tre agarplattor (samma spädning på alla tre) måste du lägga ihop summan av alla kolonier du ser på de tre plattorna och räkna ut ett medelvärde. Sedan räknar du på samma sätt. Tex om du har 20 CFU, 19 CFU och 21 CFU så blir medelvärdet av dessa 20 CFU. Nu tar du den siffrar och räknar som i det här exemplet. Alltså: 20 * spädningsfaktorn * 10. Den extra tiopotensen i formeln har att göra med spädningen mellan rören.

  3. Hejsan, mkt bra förklarat måste jag säga! Går på gymnasiet men ni förklarade så att jag fattade.
    Har en fråga till er.
    På ehinger.nu finns följande uppgift:

    ”I ett försök ville du mäta bakteriehalten i köttfärs från affären. Detta gjorde du genom att göra en späd­ningsserie, och sedan se hur många bakterier som kunde odlas upp på NA-platta.
    Du tog ut 1,0 g av köttfärsen, och blandade i 10 ml spädningsbuffert. Detta kallade du rör 1. Du förde sedan över 0,10 ml av lösningen till rör 2, där du hade 9,9 ml spädningsbuffert. Sedan förde du över 1,0 ml av lösningen i rör 2 till rör 3, där du hade 9,0 ml spädningsbuffert.
    Från rör 3 tog du till slut ut 0,10 ml lös­ning, och racklade ut på NA-platta. Efter inkubering i 37°C fick du en platta med utse­endet här intill. Hur många bakterier per gram var det i köttfärsen?”

    Är detta också viable count? Isåfall, varför skiljer sig bakteriersuspensionen så pass mkt från bakteriesuspensionen här på er hemsida?
    Vidare, varför använder används endast en NA-platta i exemplet ovan, medan ni i ert exempel på bloggen använder tre agarplattor?

    Vore jättesnällt om ni kunde hjälpa
    MVH
    steven

    1. Hej Steven, jag det verkar helt klart vara en Viable Count. Jag vet inte riktigt vad du menar med att bakteriesuspensionen skiljer sig? Menar du i antal bakterier eller att bakterierna kommer från olika ställen (köttfärs och vätska)? Bakterierna i en suspension måste komma någonstans ifrån – det kan vara köttfärs, avföring, halsen på en patient eller var som helst i från. Man lägger dem i vätskan för att de kommer från ett ställa där det är svårt att räkna dem kanske. Man kan räkna bakterier på andra sätt också, men just det här är ju en bekrivning i viable count.
      Anledningen till att man har olika plattor beror helt på vilken bakterie man har. Agarplattor är till för att odla bakterier. Det finns hundratals, kanske tusentals, olika agarplattor. De innehåller olika ämnen som får olika bakterier att trivas. Vissa agarplattor innehåller ämnen som gör att bara vissa bakterier trivs, medan andra inte trivs. Läs gärna mina fyra inlägg om Okända Prover så ser du hur jag menar. Du har helt enkelt andra bakterier i kättfärsen än jag har i min suspension.
      Anledningen till at vi hade tre plattor och inte en är nog att det skulle bli lite svårare för oss. Om man har flera plattor måste man tänka till – vilken platta ska jag ha med och vilken ska jag inte ha med? Det är bara de med 20 – 200 kolonier, inte de andra eftersom under 20 är för lite och över 200 är svårt att räkna. Om man har flera plattor med kolonier mellan 20 och 200 i antal, då kan man räkna ut ett snittvärde av dessa. Om du har 50 kolonier på en platta och 54 på en annan, då tar du 50+52 och delar det med antalet plattor 2 och får 52 kolonier. Då är det den siffran 52 som du ska räkna med, och inte 50 eller 54. Ibland har vi haft 10 plattor på universitetet.
      Hör gärna av dig igen med frågor om det är något du undrar över.
      Ha det gott!

    2. För resten, Steven, jag kan lägga till en sak. När jag skriver att man kan räkna ut snittet på antalet kolonier, då menar jag bara på de plattorna som kommer från samma rör. Man kan ha tre plattor från ett rör, och ha tio rör. Då har man 30 plattor. I det här exemplet som jag har i det här inlägget kommer alla plattor från samma rör. Men om jag har plattor från olika rör kan jag inte blanda och räkna ut snittet. Det kan vara bra att ha många rör (många spädningar) med många plattor om man inte vet hur mycket bakterier det finns. Om man inte vet hur mycket bakterier det finns i suspensionen då vet man inte heller hur mycket man kan späda innan det blir så utspätt att inga bakterier växer. Alltså är det bra att göra många spädningar, så att man är säker på att få bakterier som går att räkna.

Vad tycker du?