Biomedicinsk Analytiker

Sveriges största site för Biomedicinska Analytiker

Färgning av bakterier

Bakterier

Bakterier

Inom mikrobiologin finns flera olika metoder en biomedicinsk analytiker kan använda sig av för att identifiera bakterier. En av dem är gramfärgning. Detta har vi fått öva på under en laboration. Metoden har fått sitt namn efter upptäckaren Hans Christian Gram och bygger på kunskapen om att en bakteries cellvägg i huvudsak är uppbyggd på ett av två olika sätt. Det är cellväggens uppbyggnad som avgör om bakterien är gramnegativ eller och grampositiv. Denna kunskap är viktig därför att olika typer av antibiotika bryter ner olika typer av cellväggar.

Grampositiva bakterier

Den grampositiva bakteriens cellvägg kan vara upp till 80 nm tjock, men också så tunn som 15 nm, det varierar. Den består främst av två ämnen; mukopeptid (peptidoglukan) och teikoinsyra. Mukopeptid är ett nätverk av polysackaridkedjor  (långa kedjor av hopsatta sockermolekyler) som binds ihop med hjälp av korta peptider (kedjor av aminosyror). Nätverket gör att bakterien sitter ihop, att den håller. Teikoinsyra finns bara hos den grampositiva bakterien, och kan se lite olika ut hos olika arter av grampositiva bakterier. Syran består i alla fall av polymerer (väldigt långa kedjor) av glycerolfosfat eller ribitolfosfat. Till dessa kopplas i sin tur olika former av socker, aminosocker och aminosyror. Teikoinsyran binds kovalent till N-acetylmuraminsyran i mukopeptiden, och kan dessutom vara bunden till bakteriens cellmembran genom olika fettsyror. Syran finns på bakteriens yta som en antigen. Dessutom kan man hitta mindre mängder av andra proteiner och polysackarider i de grampositiva bakterierna. Dessa kan skilja sig åt mellan de olika grampositiva bakterierna.

Två exempel på grampositiva bakterier är Neisseria gonorrhoeae och Staphylococcus aureus.

bacteria-1832824

Gramnegativa bakterier

Den gramnegativa bakterien har en cellvägg som är tunnare, ca 10 nm, men mer innehållsrik. Mukopeptidskiktet är uppbyggt på samma sätt men är också tunnare. Aminosyrorna finns också, men sitter samman på ett annat sätt. Teikoinsyra saknas. Den gramnegativa bakterien har två membran; ett liknande membran som den grampositiva bakterien har och dessutom ett yttre membran som binds till mukopeptiden genom ett lipoprotein. På utsidan av det yttersta membranet sitter något som kallas lipopolysakarid. Detta är giftigt för oss människor. 

Två exempel på gramnegativa bakterier är Haemophilius influensae och Escherichia coli.

Färgen binder

På grund skillnaderna i cellväggens uppbyggnad binder olika färgämnen på olika sätt till gramnegativa respektive grampositiva bakterier. Man färgar båda sorterna på samma sätt med två  färgämnen; kristallviolett och safranin. De grampositiva bakterierna färgas av både kristallviolett och safranin, medan de gramnegativa bakterierna blir röda av safranin. Den kristallblå färgen fäster inte på dem. Jag ska förklara varför när jag förklarar hur själva fägringen går till. Men innan man kan färga bakterier ska ett preparat förberedas.

Förberedelse inför färgning

Hur man förbereder ett preparat beror på om bakterierna tas från en suspension (flytande form) eller en odlingsplatta (fast form). Om de tas från en suspension ska man först röra om i suspensionen, och sedan med hjälp av en pasteurpipett (liten enkel pipett med vanlig ”blåsa” som man trycker ihop och släpper för att få upp vätskan). En droppen av bakteriesuspensionen droppas på ett objektglas. Sedan rör man ut droppen så att den bli lagom stor, ca 2 cm i diameter.

Men om bakterierna tas från en odlingsplatta ligger de inte i vätska. Därför måste man börja med att ta en droppe fysiologisk Natriumklorid och droppa den på objektglaset, innan man lägger dit en liten mängd bakterier. Bakterierna rörs ut i natrimkloriden, från kanterna och in mot droppens mitt. Sedan gör man allt på samma sätt, oavsett varifrån bakterierna kommer.

Preparaten ska lufttorka, och sedan ska bakterierna fixeras så att de stannar kvar på objektglaset medan man färgar. Fixeringen är enkel, objektglasen förs snabbt genom en låga med hög temperatur (brinnande gas) tre gånger. Bakterierna ska hållas uppåt, från lågan. De dör, men förstörs inte. 

Gramfärgning

Man ska hålla objektglaset man färgar med en klädnypa eller liknande. Anledningen är att huden kan bli missfärgad om man skulle råka spilla, därför är det också viktigt att ha handskar. Man står lämpligast över ”diskhon” i laboratoriet när detta görs.

  1. Några droppar kristallviolett hälls över bakterierna på preparatet. Låt färgen verka i 1 minut. Alla bakterier färgas blå av den kristallvioletta färgen.
  2. Vänd preparatet upp-och-ner (med bakterierna neråt) och spola försiktigt på baksidan av det med kranvatten.
  3. Vänd upp preparatet igen, med bakterierna riktade uppåt. Droppa Lugols lösing (jodlösning) på preparatet. Låt verka 1 minut. Jodlösningen binder den blå färgen inne i bakterien, så att den blir kvar.
  4. Häll acetonsprit över preparatet tills dess att du inte får bort mer färg (ingen mer färg hamnar i ”diskhon”). Sprit löser fett, och acetonspriten löser upp fettet i de gramnegativa bakteriernas cellvägg. Den är ju tunn och innehåller mest fett. På det sättet kommer acetonspriten åt färgen inne i de gramnegativa bakterierna. De tappar färgen helt. Den höga halten av muren som finns i den grampositiva bakteriens cellvägg löses inte upp av acetonspriten. Därför behåller den grampositiva bakterien sin kristallvioletta färg.
  5. Vänd preparatet upp-och-ner igen. Skölj det försiktigt med kranvatten. Acetonspriten ska bort.
  6. Vänd preparatet rätt igen, med bakterierna uppåt. Häll några droppar safranin över bakterierna. Låt verka 1 minut. Safraninfärgen färgar både de gramnegativa och de grampositiva bakterierna. Men de grampositiva bakterierna har behållit sin kristallvioletta färg, och denna blandas nu med safraninfärgen. De grampositiva bakterierna får alltså en blålilla färg. De gramnegativa bakterierna blev urtvättade av acetonspriten som löste upp fettet i cellväggen och tog bort färgen i bakterien. De färgas nu bara av safraninfärgen, och får en röd färg.
  7. Vänd preparatet upp-och-ner igen. Skölj försiktigt under kranvatten. Låt det lufttorka.
  8. Nu kan preparatet mikroskoperas. Det syns tydligt i mikroskopet vilka bakterier som är grampositiva (blålila) och vilka som är gramnegativa (röda).

Här kommer en liten film som visar hur gramfärgningen går till, och hur resultatet blir.

Metylenblåfärgning

Det finns ytterligare en metod att färga bakterier, metylenblåfärgning. Metylenblått är ett basist ämne som binder till nukleinsyran i bakterierna. Syftet med gramfärgningen är ju att ta reda vilken typ av cellvägg bakterien har. Men genom att metylenblåfärga bakterier kan man ta reda på vilken storlek, form av lagring de har. Lagring innebär att bakterier kan ”hänga ihop” på olika sätt. Kocker kan exempelvis hänga ihop två och två, som diplokocker, eller i längre kedjor då de kallas streptokocker. Om flera olika kocker klumpar ihop sig kallas de stafylokocker. Kocker är runda. Andra bakterier är stavformade. Även dessa kan hänga ihop två och två eller i kedjor. Ibland ser de ut som små riskorn, och då kallas de fusiforma. Härutöver finns bakterier som är spiralformade också.

Preparatet ska förberedas på samma sätt som inför gramfärgning. Även i samband med denna färgningsmetod ska klädnypa och handskar användas, och det är bra att stå invid laboratoriets ”diskho.”

  1. Preparatet ska hållas med bakterierna vända uppåt. Häll några droppas metylenblått över bakterierna. Låt verka i 2 minuter. Alla bakterier färgas metylenblå, oavsett om de är grampositiva eller gramnegativa.
  2. Vänd preparatet upp-och-ner. Skölj det försiktigt under rinnande kranvatten.
  3. Lufttorka preparatet.
  4. Mikroskopera. Det syns tydligt i mikroskopet om bakterierna sitter ihop två och två, i långa kedjor eller i klumpar.

I sjukvårdens tjänst

Om en biomedicinsk analytiker har ett bakterieprov från en patient kan bakterierna i det provet odlas för att sedan användas till både gramfärgning och metylenblåfärgning. Hur man odlar bakterier kommer jag att ta upp vid ett senare tillfälle. Men vad som är så bra med att kombinera dessa två färgningsmetoder är att man genom dem får så mycket information att man kan bota en sjuk människa. Det räcker inte att veta endast hur bakterierna ser ut eller om de är grampositiva. Det finns olika sorters bakterier som kan ha samma lagringsmetod, men skiljer i gramtillhörighet. Om man känner till både bakteriens storlek, form, lagring och gramtillhörighet blir det lättare att avgöra vilken form av antibiotika patienten ska ha för att bli frisk.

Källa: 

Forslund, T. Odling, mikroskopering och kvantifiering av bakterier. Laboration. Linköpings Universitet. 2013-03-12.

ScienceProfOnline. How to Do a Gram Stain: Differentiate Gram-positive and Gram-negative Bacteria. Film. YouTube. 2012-09-24. (Hämtad 2013-12-11)

13 comments on “Färgning av bakterier

  1. Pingback: DIYProject: Help Discover New Antibiotics trough Citizen Science | Biomedicinsk Analytiker

  2. Pingback: Toll Like Receptorer och cellsignalering | Biomedicinsk Analytiker

  3. Pingback: Praktiskt Tentamen: Laboratorievetenskap inom endokrinologi och infektion | Biomedicinsk Analytiker

Kommentera

Fyll i dina uppgifter nedan eller klicka på en ikon för att logga in:

WordPress.com Logo

Du kommenterar med ditt WordPress.com-konto. Logga ut / Ändra )

Twitter-bild

Du kommenterar med ditt Twitter-konto. Logga ut / Ändra )

Facebook-foto

Du kommenterar med ditt Facebook-konto. Logga ut / Ändra )

Google+ photo

Du kommenterar med ditt Google+-konto. Logga ut / Ändra )

Ansluter till %s

Information

This entry was posted on 11 december, 2013 by in - Laborationer T1, - Mikrobiologi T1, Termin 1 and tagged .
%d bloggare gillar detta: