Köhlers Belysningsprincip: ställ in ditt mikroskop på rätt sätt

Det finns något som heter ”Köhlers belysningsprincip.” Detta används i samband med ljusmikroskopering och är en inställning som görs för att det en biomedicinsk analytiker tittar på i mikroskopet ska synas så bra som möjligt. Objektet blir jämnt upplyst, helt utan reflexer och med bra kontrast. Ljuskällan i mikroskopet utnyttjas då på ett så effektivt sätt att det räcker att driva den med underspänning (lampan behöver inte lysa med maximal styrka). Vi har gått igenom detta på ett seminarium, och här kommer en kort genomgång.

Förutsättningarna för Köhlers belysningsprincip

Det finns två villkor som måste vara uppfyllda för att Köhlers belysningsprincip över huvud taget ska kunna genomföras;

1. mikroskopet ska ha en höj- och sänkbar kondensor.
2. mikroskopets ljuskälla ska vara utrustad med kollektor och irisbländare.

En kollektor har linser. Den sitter närmast ljuskällan och samlar ihop ljuset innan det skickas vidare till kondensorn. Kondensorn sitter precis under objektbordet. I den finns också linser. Kondensorns uppgift är att fokusera ljuset till en stråle som riktas underifrån och upp genom objektet (det man tittarn på). Irisbländaren kan också kallas för ljusfältsbländare. Den består av några ”plattor” som tillsammans bildar en justerbar cirkel. Dessa är gömda inne i mikroskopet och syns inte, men kan justeras utifrån. Ljusfältsbländaren kan nämligen öppnas och stängas. Den har till uppgift att fokusera ljuset ännu mer. Som lite kuriosa och för att ge lite perspektiv kan jag nämna att det finns något som heter mörkerfältsbländare. Den belyser objektet från sidan. Men ljusfältbländaren beyser alltså objektet underifrån.

Inställningar

1. Kondensorn ska ställas in så att den är i sitt högsta läge, linsen och eventuellt hjälplins ska vara i ljusstrålen. Från och med nu ska alla inställningar göras medan du tittar ner genom mikroskopet och ser objektet.
2. Med hjälp av ett objektiv som har låg förstoring (till exempel 10x eller 25x) ska du ställa in mikroskopet så att man ser objektet skarpt. Detta ska göras utan hänsyn till belysningen.
3. Sedan ställer du in avståndet på okularen i binokulärtuben. Det är genom okularen du tittar ner på objektet, och bara någon millimeters felinställning kan göra stor skillnad. Det är viktigt att du kan se objektet lika bra med båda ögonen.
4. Ljusfältsbländaren stängs. Kondenstorn sänkt så att konturen av ljusfältsbländarens ”ring” som plattorna bildar syns på objektet. Det blir som ett ljust fält bara i mitten. Men det ljusa fältet kanske inte ligger just i mitten, det kan också ligga lite för mycket åt höger, vänster eller i någon av de övre eller undre kanterna.
5. Ljusfältsbländaren justeras med kondensorcenterskruvarna på ett sådant att att det ljusa fältet hamnar så nära mitten av synfältet som det bara är möjligt.
6. Ljusfältsbländaren öppnas så att konturen av dess kanter precis försvinner ut ur synfältet. Nu är vi färdiga med Köhlers belysningsprincip.

Gör dina finjusteringar

Efter alla dessa inställningar kan du dock göra några till. Med hjälp av preparatföraren kan du flytta på ett objekt, så att att du får se dess olika delar. Ljusmikroskopet har både grov- och finfokus. Med hjälp av kondensorbländaren, som sitter precis över ljusfältbländaren, kan du justera kontrasten på objektet.

Vill du kan du dessutom öka förstoringen. Vid Linköpings Universitet använder vi ljusmikroskop med en förstoring på upp till 100x. En lägre förstoring ger ett bättre skärpedjup, en högre förstoring ger sämre skärpedjup. När du byter objektiv behöver du inte göra om Köhlers inställning, men du måste ställa in grov- och finfokus på nytt. 100x-förstoringen kräver dessutom att du använder immersionsolja, vilket du kan se om du tittar på objektivet. Det sitter en svart ring runt det. Objektivet hamnar väldigt nära objektglaset, det är viktigt att kontrollera att du inte knäcker det, eftersom oljan ska ha fysiskt kontakt med objektivet.

Upplösning, förstoring och numerisk apertur

Upplösning är avståndet mellan två punkter som syns fristående från varandra. På varje objektiv finns några siffror. Det står exempelvis 100x/1,25. Vad betyder det? 100x är själva förstoringen. Det betyder att objektet förstoras 100 gånger med hjälp av det objektivet. Den andra siffran kallas numerisk apertur. Ju högre värde det är på den siffran, desto bättre är objektivet. Linsens klarhet är bättre.

Här kommer en film som också finns utlagd på min YouTube-kanal. Filmen visar hur du ställer in mikroskopet och hur det ser ut i mikroskopet när du gör inställningen. Den är inspelad den 28 januari 2017, alltså efter examen.

Läs mer om mikroskopets delar.

Källa: 

Lindroth, M. Ljusmikroskopi. Föreläsning. Linköpings Universitet. 2013-10-22.

Lindroth, M. Praktiskt mikroskopiering. Laboration. Linköpings Universitet. 2013-10-30.

Tips! Luleå Universitet har publicerat ett dokument som beskriver Köhlers belysningsprincip. Här kan du också läsa om skötsel, underhåll, lampbyte och olika felsökningar. Läs dokumentet Mikroskop, av Gulin, M. 2014-03-12. (Hämtad 2017-10-22).